肝癌放療的實(shí)驗(yàn)研究-索拉非尼的放射增敏效應(yīng)及硬化肝臟放射后的再生.pdf

1、第一部分:索拉非尼聯(lián)合放射抗人肝細(xì)胞癌放射增敏效應(yīng)的體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀察索拉非尼聯(lián)合放射對(duì)人肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1及其裸鼠移植瘤的抑瘤效應(yīng),明確索拉非尼與放射是否具有協(xié)同抗肝細(xì)胞癌效應(yīng)并對(duì)兩種方法聯(lián)合應(yīng)用的有效方式進(jìn)行探討。
　　材料與方法:研究分體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)中:(1)細(xì)胞增殖毒性試驗(yàn)。采用CCK-8法,測(cè)出索拉非尼作用SK-Hep-1細(xì)胞株48小時(shí)的半致死濃度(IC50),進(jìn)而確定索拉非尼用于

2、放射增敏實(shí)驗(yàn)的合適濃度。(2)克隆形成實(shí)驗(yàn)。分為3組,分別給予單純放射、索拉非尼作用48小時(shí)后同步聯(lián)合放射、放射后序貫應(yīng)用索拉非尼作用48小時(shí)。根據(jù)各劑量點(diǎn)存活分?jǐn)?shù)(SF),經(jīng)多靶單擊數(shù)學(xué)模型擬合,獲得細(xì)胞存活曲線,將聯(lián)合處理組與對(duì)照組進(jìn)行參數(shù)DO、SF10％、SF1％比較,得出放射增敏比(SER)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中:(1)建立人肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1裸鼠移植瘤模型。(2)荷瘤裸鼠分為3組:單純放射組、30mg/kg索拉非尼灌胃7天后放射

3、組、100mg/kg索拉非尼灌胃7天后放射組。放射劑量分別為單次Ogy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy。觀察各組腫瘤的生長延遲時(shí)間,比較腫瘤體積生長至原先2倍的生長延遲。經(jīng)Gompertz模型擬合獲得腫瘤的劑量效應(yīng)曲線,將聯(lián)合處理組與單純放射組進(jìn)行參數(shù)比較,計(jì)算出劑量修飾因子(DMF)。
　　結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)中,索拉非尼作用48小時(shí)對(duì)SK-Hep-1增殖的IC50為9.5625μM,索拉非尼濃度選用1μM,用于聯(lián)合放射組的

4、克隆形成實(shí)驗(yàn)。多靶單擊模型擬合得出,索拉非尼同步聯(lián)合放射的SER(DO)、SER(SF10％)及SER(SF1％)分別為1.1、1.3、1.2。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,30mg/kg索拉非尼聯(lián)合放射2Gy、4Gy、6Gy、8Gy后的TGD分別為5.3天、15.1天、19天、20.9天;100mg/kg索拉非尼聯(lián)合放射2Gy、4Gy、6Gy、8Gy后的TGD分別為10.9天、16.6天、20.3天、22.6天。30mg/kg及100mg/kg索拉非尼

5、聯(lián)合放射的DMF分別為1.3至1.8,以100mg/kg索拉非尼聯(lián)合放射更明顯。
　　結(jié)論:體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,索拉非尼同步聯(lián)合放射有放射增敏效應(yīng)。
　　第二部分:索拉非尼同步聯(lián)合放射抗人肝細(xì)胞癌放射增敏機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,索拉非尼同步放射治療人肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1有放射增敏作用。本研究探討索拉非尼放射增敏效應(yīng)的機(jī)制。
　　材料與方法:(1)SK-Hep-1細(xì)胞經(jīng)1μM索拉非

6、尼處理48小時(shí)后同步放射0Gy、1Gy、2Gy、6Gy,應(yīng)用Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞蛋白VEGFR-2、ERK、NF-kB及Ku70磷酸化及非磷酸化表達(dá),與單純放射組進(jìn)行比較。(2)給予SK-Hep-1細(xì)胞0Gy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy放射后,應(yīng)用ELISA法檢測(cè)放射后0h、24h、48h、72h不同時(shí)期培養(yǎng)液內(nèi)VEGF含量;并用RT-PCR檢測(cè)在0Gy、1Gy、2Gy、6Gy、8Gy放射后24h、48h,細(xì)胞的

7、VEGFmRNA表達(dá),觀察放射對(duì)人肝癌細(xì)胞分泌VEGF的影響、放射是否可以引起人肝癌細(xì)胞株過分泌VEGF。
　　結(jié)果:(1)Westernblot檢測(cè)結(jié)果:單純放射后,DNA修復(fù)蛋白Ku70磷酸化水平略增高;1μM索拉非尼處理后,VEGFR-2及Ku70磷酸化明顯抑制;索拉非尼同步聯(lián)合放射后,VEGFR-2、ERK及Ku70蛋白的磷酸化均明顯受抑制;NF-kB的磷酸化在索拉非尼聯(lián)合6Gy放射后有輕度抑制。(2)ELISA檢測(cè)結(jié)果:

8、放射后,VEGF濃度整體上高于對(duì)照組,且增長幅度強(qiáng)于對(duì)照組;在24h及48h時(shí)以2Gy放射組顯著,在72h時(shí),放射組VEGF濃度均高于對(duì)照組,1,2,4,6Gy組增高顯著(P＜0.05),其中1Gy組最明顯,8Gy組不明顯(P＞0.05)。在放射組中,以1、2、4、6Gy放射后48h-72h培養(yǎng)液中VEGF濃度為最高,放射劑量繼續(xù)增加并不能引起VEGF的升高;72h時(shí),8Gy組與對(duì)照組相比無顯著差異,明顯低于l、2、4、6Gy組。8Gy

9、高劑量放射誘發(fā)VEGF增高的效應(yīng)并不明顯,可能與高劑量放射后細(xì)胞死亡增加顯著有關(guān)。(3)RT-PCR結(jié)果:SK-Hep-1細(xì)胞8Gy放射24h后VEGF。mRNA表達(dá)增強(qiáng),48h后更為明顯;放射1Gy、2Gy、6Gy后48h,VEGFmRNA表達(dá)也明顯上升;而對(duì)照組(0Gy)在24h及48h時(shí)VEGFmRNA表達(dá)無明顯差異。用FR-2000型圖像分析系統(tǒng)對(duì)電泳圖像進(jìn)行光密度掃描,計(jì)算得到VEGFmRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量(與β-ActinmR

10、NA光密度值的比值),結(jié)果顯示,VEGFmRNA的表達(dá)隨放射劑量及放射后時(shí)間的延長,有加速升高的趨勢(shì),在8Gy放射后最為明顯。結(jié)果提示,未放射時(shí)SK-Hep-1細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF濃度隨時(shí)間延長的升高,是由于培養(yǎng)瓶中VEGF的長期蓄積;而受放射后VEGF的進(jìn)行性加速升高,與放射誘導(dǎo)的VEGFmRNA表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。
　　結(jié)論:索拉非尼放射增敏機(jī)制可能為:放射誘發(fā)SK-Hep-1細(xì)胞過高分泌VEGF,且通過上調(diào)DNA修復(fù)蛋白的表達(dá)加速

11、DNA損傷修復(fù);索拉非尼同步聯(lián)合放射后,可通過抑制VEGFR-2、ERK1/2及Ku70的磷酸化,從而抑制放射后腫瘤細(xì)胞DNA損傷的修復(fù),起到放射增敏作用。在體索拉非尼的放射增敏機(jī)制可能是:索拉非尼抑制放射后腫瘤細(xì)胞DNA損傷的修復(fù);同時(shí),放射可引起人肝癌細(xì)胞過度分泌VEGF,增加肝細(xì)胞癌(HCC)的增殖;而索拉非尼單獨(dú)或聯(lián)合放射均可明顯抑制VEGFR-2磷酸化,從而可以減少細(xì)胞膜VEGFR-2與胞外VEGF的活性結(jié)合,從而在體內(nèi)可減少

12、腫瘤新生血管形成,延緩或抑制腫瘤的生長。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示,在臨床使用放射治療HCC時(shí),同步聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼有可能增強(qiáng)局部療效,同時(shí)減少放射誘發(fā)的VEGF升高,降低復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)地轉(zhuǎn)移的幾率。
　　第三部分:肝硬化大鼠模型建立及肝硬化自然消退中肝再生的研究
　　目的:我們?cè)趯?duì)硬化肝臟放射后的肝再生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí),需要在肝硬化形成后繼續(xù)觀察120天。為此我們建立一個(gè)適合長時(shí)期觀察的肝硬化動(dòng)物模型,并對(duì)肝硬化自然消退過程中的肝功能及肝

13、再生進(jìn)行研究,所得到的數(shù)據(jù)可以作為基礎(chǔ)值,更好的理解、解釋放射實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
　　材料與方法:給予112只Wistar大鼠飲用0.03％硫代乙酰胺(TAA)29周,來建立肝硬化動(dòng)物模型。肝硬化模型建立后,將TAA撤除,繼續(xù)觀察120天,每隔30天處死5只大鼠,獲取肝臟和血液樣本,觀察硬化及肝再生的動(dòng)態(tài)變化。(1)全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清ALT、AST、ALP及PA,觀察肝功能變化;(2)三色染色觀察膠原纖維含量、血清TGF-β1濃度、T

14、GF-β1免疫組化染色表達(dá)及肝TGF-β1mRNA表達(dá)、肝羥脯氨酸含量,以此觀察肝硬化的動(dòng)態(tài)變化;(3)肝臟指數(shù)、H&E染色分析肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)(MI)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞增殖分?jǐn)?shù)(PI)、PCNA免疫組化染色表達(dá)及qRT-PCR檢測(cè)肝臟PCNAmRNA表達(dá),用于分析肝再生變化;(4)ELISA法檢測(cè)血清肝再生相關(guān)生長因子HGF、VEGF、TGF-a及IL-6。
　　結(jié)果:大鼠應(yīng)用TAA29周后,經(jīng)病理檢測(cè)證實(shí)形成肝硬化,模型

15、建立,建模率96％。模型建立時(shí),表現(xiàn)為明顯肝再生,伴肝功能不全。撤除TAA后,大鼠肝硬化出現(xiàn)自發(fā)消退,肝臟膠原纖維減少、羥脯氨酸含量下降、肝臟TGF-β1表達(dá)下調(diào)。在肝硬化消退時(shí),伴隨肝功能的改善。在肝硬化消退120天后,明顯肝纖維化仍然可見。撤除TAA后,肝再生顯著降低,肝細(xì)胞MI、PI、PCNAmRNA表達(dá)下降,免疫組化PCNA陽性染色比例下降,此外,血清HGF和VEGF也出現(xiàn)下降。
　　結(jié)論:肝硬化大鼠動(dòng)物模型可以經(jīng)口服0.

16、03％TAA29周后誘導(dǎo)形成。肝硬化能發(fā)生自發(fā)消退,消退過程中肝功能改善、肝再生下降。此模型形成的肝硬化可以維持120天以上,適合需長時(shí)期觀察的研究使用。
　　第四部分:硬化肝臟放射后肝損傷及肝再生的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究肝硬化大鼠右半肝臟給予亞致死性放射后,是否能產(chǎn)生肝再生、是否能觸發(fā)未放射的左半肝肝臟出現(xiàn)肝再生。
　　材料與方法:將研究分成連續(xù)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一中,肝硬化大鼠分成4組,即對(duì)照組(未放射)、5-0G

17、y、10-0Gy及15-0Gy組,后3組分別給予右半肝單次放射5Gy、10Gy及15Gy,左半肝不放射。將放射前定義為d0,放射后觀察120天,每隔30天,分別于d30、d60、d90及d120每組處死5只大鼠,獲取血清和肝臟標(biāo)本進(jìn)行肝損傷與肝再生評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)二的設(shè)計(jì)依賴于實(shí)驗(yàn)一結(jié)果。實(shí)驗(yàn)一結(jié)果顯示,右半肝放射5Gy、10Gy、15Gy均能引起放射半肝及未放射半肝發(fā)生肝再生,以15Gy為最明顯。實(shí)驗(yàn)二中,將肝硬化大鼠分成5組,分別為假照對(duì)

18、照組(0-0Gy)、15-0Gy、15-2.5Gy、15.5Gy及15-7.5Gy組,后4組選擇15Gy作為初始刺激放射右半肝,并同時(shí)分別放射左半肝0Gy、2.5Gy、5Gy及7.Sgy。將放射前定義為d0,放射后觀察150天,每隔30天,分別于d30、d60、d90、d120及d150每組處死5只大鼠,獲取血清和肝臟標(biāo)本進(jìn)行肝損傷與肝再生評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)一及實(shí)驗(yàn)二的觀察指標(biāo)相同:(1)肝損傷:大鼠體重、血清ALT、AST、ALP及PA;(2

19、)肝再生:肝臟指數(shù)、H&E染色分析肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)(MI)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞增殖分?jǐn)?shù)(PI)、PCNA免疫組化染色表達(dá)及qRT-PCR檢測(cè)肝臟PCNAmRNA表達(dá)、ELISA法檢測(cè)血清肝再生相關(guān)生長因子HGF、VEGF、TGF-a及IL-6;(3)血清TGF-β1濃度、TGF-β1免疫組化染色表達(dá)及肝TGF-β1mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:單純給予右半肝5Gy、10Gy、15Gy放射,或者給予右半肝15Gy放射同時(shí)左半肝放射2

20、.5Gy、5Gy、7.5Gy,均可引起肝再生,且在左右半肝均發(fā)生。肝再生指標(biāo)中,PCNA免疫組化陽性染色比例、PCNAmRNA表達(dá)、PI、MI明顯升高,以左半肝略顯著;同時(shí)血清HGF、VEGF、IL-6濃度均顯著升高。放射后肝功能受損,血清ALT、AST、ALP、TGF-β1升高,PA降低,肝組織中TGF-β1表達(dá)明顯增高,以右半肝顯著。隨放射劑量及放射肝體積增加,肝再生與肝損傷表現(xiàn)更顯著。實(shí)驗(yàn)中大鼠死亡率均不高于11.11％,實(shí)驗(yàn)使用