二惡英生物檢測體系相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá).pdf

1、　　為建立二惡英生物檢測體系，本課題在分析與研究AhR與ARNT兩個蛋白質(zhì)特征的基礎(chǔ)上，克隆表達(dá)出AhR與ARNT兩個全長蛋白及AhR的兩個特征性多肽片段，并用后者免疫動物制備多克隆抗體。這些蛋白與抗體為檢測體系的建立及相關(guān)研究奠定了重要的基礎(chǔ)。　　本研究以從C57BL/6J純系小鼠肝組織中提取的總RNA為模板，采用RT-PCR的方法擴(kuò)增目的基因，通過瓊脂糖凝膠電泳和DNA測序分析驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性后，將其定向克隆入pGEX-5X-

2、1表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建了AhR和ARNT全長及片段AhR-PAS、AhR-C、ARNT-PAS共五個蛋白的pGEX-5X-1-融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒。將酶切鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞中，通過誘導(dǎo)前后的SDS-PAGE分析，篩選出目的蛋白表達(dá)陽性的細(xì)菌克隆，通過劃板或凍存菌液的方式保存好菌種。　　然后，針對用于制備AhR多克隆抗體的兩個片段蛋白AhR-PAS和AhR-C進(jìn)行蛋白表達(dá)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化和大量提

3、純。通過對表達(dá)蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物AhR-C大部分為存在于胞質(zhì)中的可溶性蛋白，而AhR-PAS的表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在于沉淀中，且通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件無法使其以可溶性蛋白的形式表達(dá)。鑒于此，我們分別采取了GlutathioneSepharoseTM4B珠子親和吸附與包涵體純化的方法來提純這兩個片段蛋白的表達(dá)產(chǎn)物。然后利用收獲的融合蛋白，采用2002年CellResearch介紹的一種快速制備多克隆抗體的新方法免疫新西蘭