飼料中二惡英測定的化學(xué)激活熒光基因表達系統(tǒng).pdf

1、二惡英類化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中廣泛存在,不易降解,毒性高且易于生物富集/生物放大,能對環(huán)境、人和動物造成嚴重影響.1999年比利時肉雞二惡英污染事件后,DLCs引起國際社會的廣泛關(guān)注. 二惡英分析是現(xiàn)代分析的一個重點和難點.目前二惡英類物質(zhì)主要的檢測方法有化學(xué)法(色譜法)、免疫法和生物法三大類.色譜法是目前國際通用的標(biāo)準(zhǔn)方法.但到目前為止,還沒有一種能高通量、低成本進行二惡英檢測的方法. 本研究的目的是利用二惡英類化學(xué)物質(zhì)的毒

2、理機制,建立一種能滿足飼料及畜產(chǎn)品中二惡英監(jiān)測的高通量、低成本需要的方法.本研究構(gòu)建了一個受二惡英應(yīng)答元件(DRE)調(diào)控的,以增強型綠色熒光蛋白(EGFP)作為報告基因的表達質(zhì)粒,將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠肝細胞瘤H4IIE,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株.二惡英類化學(xué)物質(zhì)與該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株接觸可誘導(dǎo)EGFP呈劑量依賴性的表達,通過檢測EGFP含量即可反映二惡英類化學(xué)物質(zhì)的量. 本研究內(nèi)容分兩部分: 一.將載體質(zhì)粒pEGFP-Nl的CMV啟動

3、子去除后,用T4 DNA連接酶分步連接上MMTV啟動子和DRE片段,構(gòu)成以EGFP為報告基因的,對二惡英起特異性應(yīng)答的表達質(zhì)粒pGMD1.1.重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染大鼠肝細胞瘤H4IIE,以TCDD誘導(dǎo)綠色熒光蛋白表達,以DMSO誘導(dǎo)作陰性對照,結(jié)果表明TCDD誘導(dǎo)綠色熒光蛋白表達為DMSO誘導(dǎo)的表達量高出約10倍左右,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功. 二.將重組質(zhì)粒pGMD1.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠肝細胞瘤H4IIE,經(jīng)過4周培養(yǎng)篩選,得到1株具有T

4、CDD較強誘導(dǎo)活性的重組細胞系H4EG.1b2.然后對該細胞株的檢測條件進行了優(yōu)化. 將H4EG.1b2細胞每孔約150,000個加入黑色壁、透明底96孔培養(yǎng)板(Costar 3603)中,37℃培養(yǎng),33v與TCDD(待測物)共孵育進行熒光檢測.制定了TCDD誘導(dǎo)H4EG.1b2的標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定該方法的最低檢測限為1pM,ECso值為5pM,最大誘導(dǎo)劑量為500pM,線性范圍為1～500pM. 實驗還對一些可能對二惡英