異種器官移植用血管內皮細胞組織特異性表達人DAF、CD59轉基因小鼠的研究.pdf

1、第一部分血管內皮細胞組織特異性表達人DAF、CD59轉基因小鼠的制備目的制備原代血管內皮細胞組織特異性表達人DAF、CD59轉基因小鼠.方法用限制性內切酶XbaⅠ/BamHⅠ/ScaⅠ酶切該室構建含有人DAFcDNA外源基因的質粒,回收純化3.7kb DNA片段,依次包括人ICAM-2啟動子序列,人DAF cDNA(含人DAF基因第一個內含子)及SV40 splice/polyA終止信號.結果4~6周齡80只雌鼠經超排卵后分別與正常雄鼠

2、交配,共得到受精卵2100余枚,選取原核清晰的受精卵1700枚用于顯微注射,1300枚受精卵注射后仍健康,注射后存活受精卵的比率為76.5％(1300/1700),將它們分別移植入50只假孕母鼠的輸卵管中,其中30只受孕,足月后共產生原代鼠135只,移植受精卵的發(fā)育率為10.3％(135/1300).結論通過顯微注射方法,成功制備了轉基因原代鼠.第二部分血管內皮細胞組織特異性表達人DAF、CD59轉基因小鼠的篩選目的從原代鼠中篩選出血管

3、內皮細胞組織特異性表達人DAF、CD59轉基因小鼠.方法提取原代小鼠基因組DNA,以人ICAM-2啟動子序列為模板,用PCR方法進行外源基因整合初步篩選,并進一步對PCR檢測中出現特異條帶小鼠基因組DNA行Southern印跡雜交分析.結論該實驗成功地建立了血管內皮細胞組織特異性表達人CD59、DAF轉基因小鼠(包括2只血管內皮細胞組織特異性表達人CD59/DAF聯合轉基因小鼠).第三部分、血管內皮細胞組織特異性表達人DAF,CD59轉

4、基因小鼠的傳代和表達檢測目的獲得子一代(F1代)轉基因鼠并探討外源基因在轉基因鼠傳代中的遺傳規(guī)律.方法將2只雌性雙基因轉基因小鼠與處在生育力旺盛期健康同種雄性小鼠進行交配;從雄性人DAF基因、人CD59基因轉基因鼠中選取表達最好的分別與處在生育力旺盛期健康同種雌性小鼠進行交配,F1代小鼠篩選方法同前.結論在轉基因小鼠與普通小鼠交配的傳代過程中,產生的F1代小鼠中有50％的陽性整合鼠,表明穩(wěn)定整合的外源基因與宿主體內的自身基因一樣也依據孟

5、德爾遺傳規(guī)律遺傳到F1代.但整合的外源基因在F1代小鼠中未完全實現表達,提示有復雜的機制影響轉基因的表達.第四部分、血管內皮細胞組織特異性表達人DAF、CD59轉基因小鼠抗超急性排斥反應的檢測目的檢測轉基因小鼠離體心臟抗排斥反應能力.方法在改進的Langendorff心臟灌流裝置上,用灌注液、20％稀釋人血清分別灌注轉人DAF轉基因鼠、轉人CD59基因轉基因鼠、普通小鼠,觀察不同時間各組心臟做功情況.采用免疫組織化學方法觀察人C3c、I

6、gM灌注后在心臟心肌組織沉積情況.結論普通小鼠心臟遭受較為強烈的超急排斥反應損傷,而轉基因組心臟獲得了一定程度的抗超急排斥反應能力.該實驗建立的血管內皮細胞組織特異性表達人CD59、DAF轉基因小鼠有一定的抗超急排斥反應能力.該實驗通過導入含有血管內皮細胞組織特異性調控元件、目的基因自身第一個內含子及人DAF、CD59cDNA序列的外源基因,在轉基因小鼠體內獲得了外源基因血管內皮細胞組織特異性較為高效的表達,并且證實了血管內皮細胞組織特