GFP+小鼠胚胎干細(xì)胞ESD3大鼠腦內(nèi)移植的相關(guān)研究.pdf

1、目的：(1)全能(totipotent)區(qū)域非特異性(regionallynon-specified)的胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ESC)是研究成體不同腦區(qū)控制干細(xì)胞分化能力的一個(gè)十分有力的工具。為了了解成體腦組織對胚胎干細(xì)胞的影響及胚胎干細(xì)胞在成體腦內(nèi)的一系列行為，我們將少量未分化小鼠胚胎干細(xì)胞移植入成體大鼠腦內(nèi)幾個(gè)不同部位，以探討未分化的小鼠胚胎干(mouseembryonicstem，mES)細(xì)胞在成體大鼠大

2、腦內(nèi)各個(gè)部位的存活，生長與分化的潛能的差異。 (2)在病理?xiàng)l件下，腦內(nèi)的局部環(huán)境會(huì)發(fā)生改變，其形成的特殊環(huán)境會(huì)影響移植胚胎干細(xì)胞的行為。為了了解腦出血時(shí)的腦內(nèi)環(huán)境對胚胎干細(xì)胞的影響，我們將未分化小鼠胚胎干細(xì)胞移植入腦出血大鼠模型腦內(nèi)，初步研究小鼠胚胎干細(xì)胞在腦出血大鼠腦內(nèi)的存活與分化。 (3)同時(shí)通過本系列實(shí)驗(yàn)，可以暴露出一些在胚胎干細(xì)胞乃至其他種類干細(xì)胞移植應(yīng)用研究中將面臨的問題，為進(jìn)一步進(jìn)行干細(xì)胞移植研究打下基礎(chǔ)。

3、 方法：將小鼠胚胎干細(xì)胞用綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)標(biāo)記，經(jīng)G418篩選一月使其穩(wěn)定表達(dá)。 (1)我們將少量轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白未分化小鼠胚胎干細(xì)胞移植入成體大鼠腦內(nèi)不同部位，分別于移植后5天，14天和28天后處死大鼠，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光定性檢測，以了解未分化小鼠胚胎干細(xì)胞在大鼠腦內(nèi)不同區(qū)域的存活，生長與分化情況。 (2)制作大鼠腦出血模型，三天后移植GFP+胚胎干細(xì)胞至

4、出血灶對側(cè)側(cè)腦室內(nèi)及對照健康大鼠側(cè)腦室內(nèi)，一月后處死大鼠，行免疫熒光染色鑒定后，通過熒光顯微鏡觀察小鼠胚胎干細(xì)胞，了解其分化生長情況。 結(jié)果：(1)移植入完整大鼠大腦中的未分化小鼠胚胎干細(xì)胞可逐步遷徙入大鼠腦組織。移植細(xì)胞及其后裔在海馬生長最為旺盛，而隔區(qū)最差(p＜0.01)。移植細(xì)胞數(shù)量對其生存狀態(tài)有一定的影響，移植細(xì)胞數(shù)量過多，移植部位腦組織破壞重，細(xì)胞壞死多；而移植細(xì)胞數(shù)量太少則由于免疫反應(yīng)的存在，保證不了最終移植物的存在

5、。移植細(xì)胞與接受移植的器官的相對體積比例也是一個(gè)重要影響因素，針對不同的疾病所需要移植的不同部位必須區(qū)別對待。 移植胚胎干細(xì)胞可向nestin-ir(immunereactive)神經(jīng)干細(xì)胞分化，移植細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的效率也有位置差異，海馬最高，而隔區(qū)最低(p＜0.01)。 在各移植部位均發(fā)現(xiàn)有移植細(xì)胞來源的終末分化細(xì)胞，即神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，尤其在海馬，可見有大量的移植胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。 (2)小鼠胚胎

6、干細(xì)胞腦內(nèi)移植至大鼠側(cè)腦室后能有效穿透腦室壁，進(jìn)入腦組織，向病灶方向遷徙，腦出血增加了移植入側(cè)腦室的GFP+小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)的數(shù)量(p＜0.01)。 因?yàn)楣w細(xì)胞突破側(cè)腦室壁的部位不盡相同，并沿腦室向病灶方向遷徙，細(xì)胞分化情況很復(fù)雜。我們發(fā)現(xiàn)對照組分化較為明顯，尤其是遷移入海馬組織的可高比例的分化為nestin-ir細(xì)胞；相反卒中組移植細(xì)胞則多無神經(jīng)相關(guān)標(biāo)記的表達(dá)，存活細(xì)胞周圍可見大量宿主來源的反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞。遷移至

7、病灶周圍的細(xì)胞也有分化為nestin-ir的。在nestin-ir細(xì)胞分布區(qū)還間雜著數(shù)量不等的NeuN+(neuronalnucleiprotein)與GFAP+(glialfibrillaryacidicprotein)的移植細(xì)胞，即移植細(xì)胞可向神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等終末細(xì)胞分化。 結(jié)論：(1)只有部分腦區(qū)構(gòu)成適合胚胎干細(xì)胞及其后裔生存，并促進(jìn)其分化的有益環(huán)境。因此，位置特異的微環(huán)境因子及環(huán)境對移植細(xì)胞的影響，凸現(xiàn)了宿主組織特