傷寒多糖結(jié)合疫苗的生物合成研究.pdf

1、傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica subspecies enterica serotype Typhi）是引發(fā)人類急性腸道傳染病傷寒的病原菌，具有強(qiáng)的侵襲性，產(chǎn)生內(nèi)毒素，由糞-口途徑傳播。傷寒是一種以發(fā)熱為主要表現(xiàn)的全身性疾病，曾在世界各地流行。隨著生活衛(wèi)生條件的改善和抗生素（特別是氯霉素）的使用，傷寒的發(fā)病率與其導(dǎo)致的死亡率在發(fā)達(dá)國(guó)家有大幅度的下降，而在亞非拉的一些發(fā)展中國(guó)家依舊是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。傷寒的常規(guī)

2、治療方式是抗生素療法，但抗生素的長(zhǎng)期使用造成了傷寒菌多重耐藥株的產(chǎn)生。而接種疫苗，是除了改善衛(wèi)生條件之外最有效的預(yù)防和控制手段，目前在全球范圍內(nèi)廣泛使用的是注射用 Vi多糖疫苗和口服的Ty21a活疫苗。
　　由于多糖疫苗屬于非 T細(xì)胞依賴性抗原，免疫后不形成免疫記憶，產(chǎn)生的抗體主要是親和力較低的IgM和IgG2，且不能在嬰幼兒體內(nèi)產(chǎn)生有效的免疫力，而將細(xì)菌的聚糖與適當(dāng)?shù)牡鞍纵d體結(jié)合形成糖蛋白疫苗，屬于T細(xì)胞依賴性抗原，能夠產(chǎn)生更好

3、、更長(zhǎng)久的免疫保護(hù)效果。細(xì)菌中存在糖基化修飾、細(xì)菌蛋白糖基化過(guò)程與脂多糖的合成的相似性以及pgl基因簇具有糖基化底物蛋白功能的發(fā)現(xiàn)，使得O抗原與免疫蛋白載體在細(xì)菌體內(nèi)結(jié)合成為了可能。
　　本文采用改進(jìn)的λ-Red重組系統(tǒng)，成功構(gòu)建了傷寒菌50096 waaL基因缺失株，同時(shí)利用低拷貝質(zhì)粒成功構(gòu)建了waaL回復(fù)株。對(duì)這野生株和新構(gòu)建的缺失株、回復(fù)株進(jìn)行脂多糖（LPS）銀染實(shí)驗(yàn)，鑒定3株菌LPS表型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺失waaL基因?qū)е?

4、LPS無(wú)法正常合成，在檢測(cè)凝膠中未形成長(zhǎng)串的梯狀條帶。接著，對(duì)所構(gòu)建的菌株進(jìn)行生理生化特征研究，結(jié)果表明waaL的缺失對(duì)菌的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響。隨后，向缺失株中導(dǎo)入含腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）蛋白糖基化途徑中糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)載體，以及改構(gòu)的重組銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）外毒素 A（rEPAN29）的表達(dá)載體，使重組菌細(xì)胞內(nèi)能夠誘導(dǎo)合成以傷寒OPS為目標(biāo)抗原、以rEPAN

5、29為載體蛋白的傷寒OPS-rEPAN29糖蛋白復(fù)合物。隨后對(duì)其進(jìn)行了IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳以及雙向電泳檢驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果顯示，重組菌能表達(dá)傷寒 OPS-rEPAN29糖蛋白復(fù)合物，且其蛋白表達(dá)譜僅存在較小差異。最后對(duì)糖蛋白復(fù)合物進(jìn)行了分離純化與免疫原性評(píng)價(jià)，ELISA測(cè)定血清抗體滴度表明，rEPAN29做為載體蛋白能有效增加糖鏈的免疫原性，糖蛋白比單獨(dú)的多糖能誘導(dǎo)產(chǎn)生更好的免疫應(yīng)答。
　　該方法成功制備了傷寒O多糖結(jié)