椎動脈缺血型頸椎病肝陽化風(fēng)證患者外周血單個核細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，建立椎動脈缺血型頸椎病(Cervical Spondylosis of Vertebral Artery,CSA)肝陽化風(fēng)證和肝陽上亢證及健康對照組高分辨率的二維凝膠電泳圖譜，比較3組蛋白質(zhì)組的表達異同，對差異表達的蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫搜索，初步確定椎動脈缺血型頸椎病肝陽化風(fēng)證患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中差異表達的蛋

2、白質(zhì)，從同病異證的角度為闡明中醫(yī)肝陽化風(fēng)證的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。 方法:設(shè)頸椎病肝陽化風(fēng)證組、頸椎病肝陽上亢證組及健康人對照組3組，取外周靜脈血分離單個核細胞提取蛋白質(zhì)，經(jīng)雙向凝膠電泳，考馬斯亮藍染色獲取凝膠圖譜，以PDQuest V7.3.1軟件對三組表達圖譜進行差異分析，選定差異蛋白點進行質(zhì)譜分析和SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)。采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription polymerase

3、 chain reaction,RT-PCR)技術(shù)對差異表達蛋白中的(纖)絲狀肌動蛋白成帽蛋白β(F-actin caping proteinsubunit beta，CAPZ-β)在mRNA水平進行驗證。 結(jié)果: 1.各組PBMCs總蛋白2-DE圖譜建立及差異蛋白質(zhì)識別：分別獲得了頸椎病肝陽化風(fēng)證組、肝陽上亢證組、健康人組PBMCs總蛋白2-DE圖譜，通過PDQuest7.3.1分析軟件進行點檢測，獲得了三組圖譜的蛋白

4、質(zhì)點數(shù)，健康組587個，肝陽化風(fēng)證組622個，肝陽上亢證組584個。通過比較分析，差異表達的蛋白質(zhì)點數(shù)為19個，進行質(zhì)譜鑒定，鑒定出14種蛋白質(zhì)。肝陽化風(fēng)組與正常組比較，發(fā)現(xiàn)16個蛋白質(zhì)點在肝陽化風(fēng)證組中差異表達，3個表達上調(diào)，10個表達下調(diào)，3個缺失。肝陽上亢證組與正常組比較，發(fā)現(xiàn)12個蛋白質(zhì)點在肝陽上亢證組中差異表達，2個表達上調(diào)，6個表達下調(diào)，4個缺失。肝陽化風(fēng)證組與肝陽上亢證組比較，分析發(fā)現(xiàn)16個差異表達蛋白點，3個表達相同蛋白

5、質(zhì)點。鑒定出的蛋白質(zhì)涉及凋亡相關(guān)蛋白、抗氧化蛋白、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、細胞骨架蛋白、假想和未知蛋白等。 2.RT-PCR驗證差異蛋白CAPZ-β表達結(jié)果：與正常組比較，肝陽上亢證組和肝陽化風(fēng)證組CAPZ-β表達量均明顯增加(P<0.05)，肝陽上亢證組與肝陽化風(fēng)證組比較，后者CAPZ-β表達量明顯高于肝陽上亢證組(P<0.05)，與蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果一致。 結(jié)論: 1.初步建立了椎動脈缺血型頸椎病肝陽化風(fēng)證和肝陽上

6、亢證的雙向凝膠電泳圖譜。 2.椎動脈缺血型頸椎病肝陽上亢證與肝陽化風(fēng)證(肝陽風(fēng)化證由肝陽上亢證發(fā)展而來)有相同表達的蛋白，提示同病異證有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)，但肝陽上亢與肝陽化風(fēng)為中醫(yī)不同證型，兩組圖譜及蛋白質(zhì)表達具有明顯差異，提示肝陽化風(fēng)證和肝陽上亢證又有不同的本質(zhì)內(nèi)涵。 3.CAPZ-β的RT-PCR結(jié)果驗證與蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果一致，證明了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的穩(wěn)定性及結(jié)果的可靠性。肝陽上亢證與肝陽化風(fēng)證均有CAPZ-β表達上調(diào)