低分子肝素對大鼠角膜堿燒傷后VEGF和HGF表達的影響.pdf

1、目的：角膜堿燒傷后新生血管的形成機制及藥物治療一直是研究關(guān)注的重點，其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)已經(jīng)被證實在角膜新生血管的形成過程中發(fā)揮著核心作用。近年的研究表明肝細胞生長因子(HGF)也是一種較強的促新生血管生長因子，且發(fā)現(xiàn)低分子肝素(LMWH)可抑制新生血管生成，但HGF與角膜新生血管的關(guān)系及LMWH抑制角膜新生血管的研究國內(nèi)外報道較少。本實驗通過堿燒傷制備大鼠角膜新生血管模型，測量HGF和VEGF在角膜堿燒傷后不同時間的蛋白及

2、mRNA表達，觀察LMWH對角膜新生血管的抑制作用，并探討眼局部應(yīng)用LMWII抑制角膜新生血管的作用機制。 方法：選用健廢Wistar大鼠48只，隨機選取8只為正常組，其余40只制備堿燒傷角膜新生血管模型，并隨機分為治療組和對照組各20只。治療組按0.5IU/g每日球結(jié)膜下注射LMWH，對照組每日球結(jié)膜下注射相應(yīng)量的生理鹽水，連續(xù)注射7天。裂隙燈顯微鏡下觀察角膜新生血管情況，并用數(shù)碼相機照相記錄，測量傷后1d、4d、7d、14d

3、角膜新生血管面積，并在正常組2只處死，其余兩組隨機選取5只大鼠斷頭法處死，摘取右眼角膜，鼻側(cè)1/2角膜固定于4％多聚甲醛溶液中用于HE和免疫組化檢測HGF及VEGF的蛋白表達，顳側(cè)1/2角膜固定于低溫(-70℃)保存用于逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測HGF及VEGF的mRNA表達。實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。結(jié)果：1 裂隙燈顯微鏡觀察：生理鹽水組傷后第1d可見角膜水腫，角膜緣血管網(wǎng)充盈；第2d角膜緣有新生血管長入；第

4、7d達到高峰，角膜新生血管密集，范圍廣，覆蓋整個角膜；第14d角膜新生血管減退。低分子肝素組傷后第1d角膜水腫較輕，角膜緣血管網(wǎng)充盈較輕，第2d角膜緣未見新生血管長入，第4d、第7d角膜血管較未用藥組稀疏，第14d血管減退較未用藥組明顯。 2.角膜新生血管面積統(tǒng)計：堿燒傷后第1d，生理鹽水組和LMWH組均無新生血管生長。傷后第4d、7d、14d，生理鹽水組角膜新生血管面積(mm2)分別為15.10±0.18、28.82±0.37

5、、39.45±0.45，而LMWH組分別為12.36±1.12、21.50±1.68、35.01±1.64，傷后第4d、7d、14d LMWH組角膜新生血管面積均較生理鹽水組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(第4dt=4.281，P＜0.05；第7d t=9.504，P＜0.01；笫14d t=5.808，P＜0.01)。 3.角膜組織HGF及VEGF免疫組織化學(xué)染色3.1 角膜HGF的蛋白表達：HGF在正常大鼠角膜內(nèi)皮層少量表達，堿燒傷

6、后第1、4、7、14d，生理鹽水組角膜HGF面密度值分別為0.3199±0.0092、0.6973±0.0102、0.5071±0.0101、0.3940±0.0540， LMWH組角膜VEGF的而密度值分別為0.2950±0.0054、0.4838±0.0102、0.3713±0.0059、0.3497±0.0137。傷后第1d、4d、7d、14d，生理鹽水組與LMWH組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 3.2 角膜VEG

7、F的蛋白表達：正常大鼠角膜未見VEGF染色陽性，堿燒傷后第1、4、7、14d，生理鹽水組角膜VEGF面密度值分別為0.3506±0.0077、0.8746±0.0109、0.5928±0.0910、0.4477±0.0355。LMWH組角膜VEGF的面密度值分別為0.3 1 58±0.055、0.6748±0.0960、0.3970±0.0084、0.3371±0.04208。傷后第1d、4d、7d、14d，生理鹽水組與LMWH組間差異

8、有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 4 角膜HGF及VEGF的RT-PCR檢測4.1 HGF mRNA表達情：HGF mRNA在正常角膜組織中少量表達，堿燒傷后第1、4、7、14d，生理鹽水組角膜HGF光密度值分別為30.94±2.70、78.08±3.06、65.67±0.48、28.62±4.90，LMWH組角膜HGF的光密度值分別為25.20±1.02、49.25±4.60、40.20±1.82、23.05±4.80。傷后第1、4、7

9、、14d，LMWH組HGF光密度值較生理鹽水組明顯降低，差異有顯著性意義(P＜0.01)。 4.2 VEGF mRNA表達情況：正常角膜內(nèi)未見VEGF mRNA表達。堿燒傷后第1、4、7、14d，生理鹽水組角膜VEGF光密度值分為為40.46±3.26、88.26±2.90、68.80±5.40、42.68±2.64，LMWH組角膜VEGF的光密度值分別為31.20±1.92、60.49±4.60、54.68±1.80、38.0

10、8±0.86。傷后第4d，LMWH組VEGF光密度值較生理鹽水組明顯降低，差異有顯著性意義(P＜0.01)，第1、7、14d，LMWH組與生理鹽水組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論：1 HGF及VEGF參與了堿燒傷后角膜新生血管的形成過程，并在CNV的形成過程中起著重要的作用。 2.HGF及VEGF在角膜組織的高表達，及表達濃度平衡的破壞促進角膜新生血管的生成。 3.LMWH通過抗血栓和抑制纖維蛋白形成