脈絡(luò)膜黑色素瘤微循環(huán)模式及姜黃素聯(lián)合內(nèi)皮抑素對眼內(nèi)移植瘤的影響.pdf

1、目的： 1.研究脈絡(luò)膜黑色素瘤中不同微循環(huán)模式與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系；闡明其不同微循環(huán)模式中MMP-2、MMP-9、EphA2及VEGF的表達(dá)及意義。 2.探討姜黃素聯(lián)合內(nèi)皮抑素對眼內(nèi)黑色素移植瘤微循環(huán)模式及生長的抑制作用；研究其對MMP-2、MMP-9、Epha2及VEGF表達(dá)的影響，從而揭示二者從不同途徑抑制腫瘤血管生成的相關(guān)分子機(jī)制，為臨床惡性腫瘤的治療提供新靶點(diǎn)，為尋求高效低毒的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、 方法： 1.收集脈絡(luò)膜黑色素瘤56例，復(fù)讀HE染色切片，初步觀察其微循環(huán)模式，利用電鏡觀察血管生成擬態(tài)的超微結(jié)構(gòu)；采用CD34/PAS雙重染色進(jìn)一步確認(rèn)脈絡(luò)膜黑色素瘤中內(nèi)皮依賴性血管(E)、馬賽克血管(MV)、血管生成擬態(tài)(VM)三種微循環(huán)模式。根據(jù)有無VM分組。分別計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)、MV及VM，以探討其與病人臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系；使用單因素和多因素生存分析研究VM對預(yù)后的影響；免疫組化染色檢測并比較MMP-2、MM

3、P-9、Epha2及VEGF蛋白的表達(dá)，分析這些分子在VM形成中的作用。 2.C57/BL6小鼠72只，右眼視網(wǎng)膜下腔注射1×105B16黑色素瘤細(xì)胞懸液建立移植瘤模型。接種后第3天開始腹腔注射給藥，持續(xù)18天；給予姜黃素(100mg/kg/日)和內(nèi)皮抑素(10mg/kg/日)處理，依據(jù)處理方式不同分為4組：對照組、姜黃素組、內(nèi)皮抑素組、姜黃素聯(lián)合內(nèi)皮抑素組。于取材前每組挑選2只進(jìn)行活性炭示蹤，以判斷VM的功能；每組選2只，用于

4、電鏡觀察VM結(jié)構(gòu)；同時(shí)完整摘取腦、肺、肝、腎、脾，觀察藥物毒副作用及有無轉(zhuǎn)移；用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，比較腫瘤的大小及生長速度；免疫組化法檢測并比較移植瘤組織中MMP-9、MMP-2、Epha2及VEGF表達(dá)水平的差異；同時(shí)采用RealtimeRT-PCR技術(shù)檢測并比較各組MMP-2、MMP-9、EphA2mRNA表達(dá)量的差異。 結(jié)果： 1.(1)VM與與性別、眼別、年齡無關(guān)(p=0.618，0.560，0.687)，而

5、與細(xì)胞類型、腫瘤最大直徑(LTD)、轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中含有類上皮細(xì)胞患者瘤組織中的VM陽性率(91.67％)高于無類上皮細(xì)胞者(48.30％)(P=0.025)；有轉(zhuǎn)移者VM陽性率(81.80％)高于無肝轉(zhuǎn)移病人(37.80％)(P=0.027)；腫瘤最大直徑>12mm的患者VM陽性率(58.5％)高于=12mm者(47.8％)(P=0.021)。 (2)MVD與性別、眼別、年齡無關(guān)(P=0.266，0.430，

6、0.316)，而與細(xì)胞類型、腫瘤最大直徑(LTD)及轉(zhuǎn)移有關(guān)。并且有類上皮細(xì)胞的瘤組織中MVD(53.48±5.14)高于無類上皮細(xì)胞者(38.55±3.32)(P=0.017)；腫瘤最大直徑>12mm者M(jìn)VD(55.80±4.86)高于腫瘤最大直徑=12mm的MVD(40.16±3.88)(P=0.014)；有轉(zhuǎn)移患者的MVD(64.27±8.16)高于無轉(zhuǎn)移者M(jìn)VD(41.18±3.08)(P=0.003)。 (3)VM組中

7、MVD略微低于對照組MVD，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.082)。 (4)單因素生存顯示，VM組患者生存時(shí)間與對照組相比較短(P=0.0076)；腫瘤細(xì)胞類型、腫瘤最大直徑、轉(zhuǎn)移、MVD對患者預(yù)后有影響(P=0.0193，0.0231，0.0328，0.0321)；而性別、年齡、眼別對預(yù)后無影響(P=0.662，0.278，0.885)；多因素生存分析顯示，腫瘤細(xì)胞類型、腫瘤最大直徑及VM是影響CM患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0

8、.005，0.000，0.003)。 (5)免疫組化染色結(jié)果：MMP-2、MMP-9在VM組中的陽性率分別為96.15％與100.0％高于對照組66.67％與80.00％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，0.002)。并且VM組MMP-2、MMP-9表達(dá)量增高，分別為(57.16±6.39)、(55.96±7.67)高于對照組表達(dá)量(36.18±4.55)(38.75±4.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，0.000)

9、；EphA2在VM組中的陽性率92.31％高于對照組陽性率70.00％，表達(dá)量也隨之增高(39.807±8.79)，高于對照組表達(dá)量(33.36±4.86)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002，0.002)；VEGF在VM組與對照組的陽性率及表達(dá)量之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.089，0.419)。 2.(1)免疫組化雙重染色和電鏡結(jié)果顯示：眼內(nèi)移植瘤微循環(huán)模式中三種微循環(huán)2.(1)免疫組化雙重染色和電鏡結(jié)果顯示：眼內(nèi)移植瘤微

10、循環(huán)模式中三種微循環(huán)模式共存。MVD及MV數(shù)目在各實(shí)驗(yàn)組瘤組織中明顯降低(P<0.05)；MV數(shù)目僅在姜黃素組及聯(lián)合組瘤組織中顯著減少(P<0.05)。 (2)活性炭示蹤結(jié)果顯示：移植瘤中VM結(jié)構(gòu)中央?yún)^(qū)大量黑色炭顆粒出現(xiàn)，提示VM與內(nèi)皮依賴性血管是相互連通的，以不同的方式維持腫瘤組織的血液供應(yīng)。 (3)腫瘤體積測量及器官轉(zhuǎn)移結(jié)果：各處理組腫瘤均較對照組生長緩慢(F=8.30，P<0.05)；其中，姜黃素組、聯(lián)合組與對照組

11、之間腫瘤平均生長體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組肺轉(zhuǎn)移率5.6％低于對照組16.7％，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 (4)免疫組化及實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果：①M(fèi)MP-9、MMP-2、EphA2胞漿陽性著色，棕黃色，腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)率從高到低依次為對照組、內(nèi)皮抑素組、姜黃素組、聯(lián)合組；VEGF陽性表達(dá)率內(nèi)皮抑素組最低，對照組最高。而且MMP-2、MMP-9、EphA2及VEGF在各處理組中的表達(dá)與對照組比

12、較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.48，F(xiàn)=17.35，F(xiàn)=4.56，F(xiàn)=6.08，，P<0.05)。②MMP-2、MMP-9及Epha2mRNA在各處理組表達(dá)量也明顯低于對照組(F=19.35，F(xiàn)=19.43，F(xiàn)=8.13，P<0.05)，其中MMP-2、MMP-9mRNA在姜黃素組及聯(lián)合組與對照組之間平均表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.17，4.53，P<0.05)；EphA2mRNA表達(dá)量在聯(lián)合組瘤組織中明顯降低(t=2.52，P

13、<0.05)。 結(jié)論： 1.(1)在脈絡(luò)膜黑色素瘤中，VM、MVD與腫瘤細(xì)胞類型、腫瘤最大直徑及轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤體積越大，VM陽性率越高，且患者越易發(fā)生轉(zhuǎn)移，有VM患者的生存時(shí)間明顯短于無VM者；含有類上皮細(xì)胞的CM中VM陽性率增高。 (2)VM可作為判斷脈絡(luò)膜黑色素瘤患者預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)，是影響其預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 (3)VM陽性的脈絡(luò)膜黑色素瘤中MMP-2、MMP-9及EphA2表達(dá)明顯增高，而VEGF

14、無顯著升高，提示VM的形成機(jī)制不同于經(jīng)典的內(nèi)皮依賴性血管生成，MMP-2、MMP-9、EphA2是VM形成中的重要分子，VEGF不是影響VM的主要因素。 2.(1)眼內(nèi)移植瘤組織并存有VM、馬賽克血管和內(nèi)皮依賴性血管三種微循環(huán)模式，并且VM與宿主血管相連，共同為腫瘤提供營養(yǎng)。 (2)姜黃素主要通過下調(diào)MMP-2、MMP-9及EphA2的表達(dá)，抑制VM的形成及腫瘤血管生成。內(nèi)皮抑素主要通過下調(diào)VEGF的表達(dá)，抑制內(nèi)皮依賴性