NF-kB誘捕ODNs抑制肺成纖維細(xì)胞膠原形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺成纖維細(xì)胞膠原分泌增加，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積是肺纖維化(PulmonaryFibrosis,PF)的主要病理形態(tài)學(xué)改變，其分泌的膠原主要是Ⅰ型和Ⅲ型。肺成纖維細(xì)胞膠原分泌增加是肺纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，減少肺成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)被認(rèn)為是治療肺纖維化的有效方式。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要而復(fù)雜的作用，在各種細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TransformingGrowthFactor-β1,TGF-β1)對(duì)肺成纖維細(xì)胞膠

2、原分泌的影響作用最大。因此該信號(hào)傳導(dǎo)途徑在肺纖維化中的作用成為近年研究熱點(diǎn)。 核因子-κB(NuclearFactor-κB，NF-κB)能與多種細(xì)胞因子上游啟動(dòng)子的特定結(jié)合位點(diǎn)作用，從而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的基因表達(dá)。NF-κB對(duì)TGF-β1基因表達(dá)的上調(diào)作用已在多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)，鑒于TGF-β在肺纖維化中的重要作用，通過(guò)抑制NF-κB的活性，來(lái)抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)肺成纖維細(xì)胞膠原分泌的上調(diào)作用，從而減少肺成纖維細(xì)胞

3、的膠原分泌，可望成為肺纖維化的有效治療策略。 本研究目的是通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的NF-κB誘捕寡核苷酸策略(decoy-oligonu--cleotides，DecoyODNs)抑制體外肺成纖維細(xì)胞NF-κB的活性，觀察肺成纖維細(xì)胞的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)量變化情況，為肺纖維化治療探索新的治療途徑。 本課題進(jìn)行了以下兩個(gè)方面的研究：1、應(yīng)用肺組織塊法、差時(shí)貼壁法原代培養(yǎng)、純化小鼠肺成纖維細(xì)胞，TGF-β5ng/ml刺激后

4、用ODNs-脂質(zhì)體復(fù)合物進(jìn)行干預(yù)，采用凝膠電泳阻滯法(Electro-phoreticMobilityShiftAssay,EMSA)檢測(cè)不同劑量及不同時(shí)間點(diǎn)條件下NF-κB的活性變化；2.通過(guò)RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)NF-κB活性被抑制后肺成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量。 主要結(jié)果： 1.應(yīng)用肺組織塊法及差時(shí)貼壁法相結(jié)合原代培養(yǎng)小鼠肺成纖維細(xì)胞，得到高純度肺成纖維細(xì)胞。 2.用EMSA檢測(cè)NF-κB活性

5、證實(shí)，與對(duì)照組比較，decoyODN-脂質(zhì)體復(fù)合物干預(yù)肺成纖維細(xì)胞后，NF-κB的活性明顯下降(P＜0.05)。decoyODN濃度為2μg/ml時(shí)，NF-κB活性有所下降，不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，濃度為4μg/ml時(shí)NF-κB的活性下降(P＜0.05)，但濃度為8μg/ml時(shí)NF-κB的活性最低。decoyODN干預(yù)2小時(shí)后即可觀察到NF-κB的活性下降，24小時(shí)后NF-κB的活性仍未恢復(fù)。 3.通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

6、應(yīng)(reversetranscriptase-polymerasechainreaction，RT-PCR)反應(yīng)檢測(cè)NF-κB活性被抑制后肺成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量顯示，NF-κB活性被抑制后，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)量均下降(P＜0.05)，其表達(dá)量與NF-κB活性程度呈正相關(guān)。decoyODN干預(yù)后2小時(shí)，Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量下降不明顯，干預(yù)后6小時(shí)，膠原mRNA表達(dá)量開(kāi)始下降，到干預(yù)后24小時(shí)

7、，膠原mRNA表達(dá)量仍處于較低水平。 主要結(jié)論： 1.肺組織塊法與差時(shí)貼壁法結(jié)合應(yīng)用可有效分離、純化小鼠肺成纖維細(xì)胞。第3～5代細(xì)胞適用于以肺成纖維細(xì)胞為觀察對(duì)象的實(shí)驗(yàn)研究。 2.陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的NF-κB誘捕寡核苷酸策略能有效抑制NF-κB的活性。相對(duì)于2μg/ml及4μg/ml，8μg/ml的decoyODN濃度對(duì)NF-κB活性的抑制作用最好。 3.decoyODN作用于肺成纖維細(xì)胞早期即發(fā)揮對(duì)NF

8、-κB的抑制作用，加入decoyODN2小時(shí)后NF-κB的活性最低，其對(duì)NF-κB的抑制作用至少持續(xù)22小時(shí)。decoyODN對(duì)NF-κB活性影響的時(shí)效關(guān)系為該方法的進(jìn)一步應(yīng)用提供基本數(shù)據(jù)。 4.抑制NF-κB的活性能有效減少體外肺成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)量，提示抑制NF-κB的活性可減少肺纖維化過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。 5.decoyODN作用于肺成纖維細(xì)胞6小時(shí)即可抑制膠原mRNA表達(dá)，抑制作用至少