兩株香蕉內生細菌的分離鑒定及其對香蕉枯萎病的生防效果評價.pdf

1、本研究從香蕉枯萎病(BananavasicularWilt)重病園區(qū)，生長正常的香蕉假莖內分離獲得兩個菌株B215和E353。通過離體拮抗測定和對小苗生防效果評價，確認B215、E353對香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense，F(xiàn)OC)具有良好的生防作用。其次在確定兩菌株分類地位的基礎上對其培養(yǎng)條件、定殖狀況、致病性、拮抗機理等做初步研究。結果如下： 1、通過組織研磨法從香蕉假莖內分離出B215

2、和E353兩個菌株，通過對峙培養(yǎng)和孢子萌發(fā)抑制初步測定，B215、E353對香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉彎孢霉葉斑病菌、香蕉鏈格孢葉斑病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有良好拮抗效果。B215培養(yǎng)液濾液使香蕉4種病菌真菌分生孢子和菌絲畸變膨大成球狀或串珠狀，其EC50分別為4.12％、5.14％、6.16％和5.96％。E353培養(yǎng)液濾液使香蕉4種病菌真菌分生孢子，致畸膨大成絮狀或串珠狀，其EC50分別為4.57％、6.14％、4.48％和

3、7.59％。 2、通過形態(tài)學特征、生理生化和16SrDNA序列測定，對篩選的兩株拮抗細菌B215、E353進行了鑒定。 形態(tài)特征、生理生化試驗顯示，B215菌落乳白色，革蘭氏染色陽性，石蕊牛奶不產(chǎn)酸。淀粉水解、硝酸鹽還原反應、明膠液化均為陽性。氧化酶反應為陰性?？梢栽诤?％NaCl和pH5.7的NA培養(yǎng)基上生長。根據(jù)這些特征，按照《芽孢桿菌屬》相關的分類檢索表，將B215鑒定為芽孢桿菌(Bacillus)。E353菌落淡

4、黃色，具有波狀或珊瑚形的邊緣。革蘭氏染色陰性。對紅霉素敏感。硝酸鹽還原、果膠水解均為陽性。明膠液化、淀粉水解均為陰性。不能在7％NaCl和pH5.7的培養(yǎng)基上生長。按照《植物病原細菌學》、《伯杰細菌鑒定手冊》鑒定手冊相關的分類檢索表，將E353鑒定為歐文氏菌(Erwinia)。 利用PCR技術分別擴增兩個菌株16SrDNA序列并測序，將測序結果在NCBI網(wǎng)絡上搜索、比對，結果顯示，B215的16SrDNA序列與已報道的枯草芽孢桿

5、菌(Bacillussubtilis)相應序列具有100％的同源性，二者在所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一個分支；E353與已報道的歐文氏菌屬菊歐氏桿菌(Erwiniachrysanthemi)相應序列具有99％以上的同源性，在構建的系統(tǒng)進化樹上與菌株距離最近。 根據(jù)上述形態(tài)特征、生理生化和16SrDNA序列分析結果，將B215鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，將E353鑒定為歐文氏菌屬菊歐氏桿菌(Erwiniachrys

6、anthemi)。 3、兩株拮抗內生菌對香蕉枯萎病的生防效果評價，通過室內平板對峙培養(yǎng)、分生孢子萌發(fā)抑制懸滴法，菌株傳代的拮抗穩(wěn)定性測定，并在優(yōu)化兩個菌株的培養(yǎng)條件的基礎上，進行溫室小苗試驗。 對峙培養(yǎng)顯示，B215明顯抑制香蕉枯萎病菌菌絲生長，抑菌帶寬度為0.5～0.6cm。B215培養(yǎng)液濾液使FOC分生孢子和菌絲變形，分生孢子和菌絲生長點膨大成球狀或串珠狀畸形,原生質外泄，細胞崩潰干癟。B215從第1代到第40代的培

7、養(yǎng)液濾液抑制FOC孢子的EC50大小差異很小，在4.12％～5.39％之間波動。 E353與FOC對峙培養(yǎng)形成的抑菌帶寬度為0.8～1.0cm，E353培養(yǎng)液濾液使FOC分生孢子致畸膨大成絮狀。E353轉管傳代40次，其培養(yǎng)液濾液抑制FOC的EC50在4.55％～5.36％之間波動。 在NA培養(yǎng)基上，獲得B215最佳培養(yǎng)條件：裝液量為50mL/500mL，最適初始pH值為7.0～7.5，初始接菌量為1％，培養(yǎng)溫度為28℃

8、;E353最佳培養(yǎng)條件：裝液量為100mL/500mL，初始pH值為7.0，初始接菌量為1％，培養(yǎng)溫度為30℃。在優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件的基礎上，通過正交設計優(yōu)化溫室盆栽試驗，結合土壤中殘余的FOC數(shù)量，在接種一定數(shù)量FOC(5×106cfu/mL)時，得出菌株B215、E353對FOC生防的最佳組合均為：在小苗定植前，用活菌培養(yǎng)液(750mL/株)浸根，可以降低小區(qū)的FOC發(fā)病率。進一步的試驗結果顯示：盆缽試驗B215、E353對FOC的防

9、效分別為62.95％和60.67％。 4、通過灌根傷根和針刺等植株體外接種方法，檢測菌株在香蕉假莖內的定殖力，同時測定拮抗菌株對香蕉植株的致病性。同時經(jīng)過不同的溫度和酸堿度處理后，對菌株培養(yǎng)液濾液的理化性質做初步研究。 菌株B215、E353均可在香蕉假莖內定殖且時間持續(xù)25d以上，對香蕉植株無致病性。菌株回收后通過拮抗性測定、形態(tài)特征鑒定、16SrDNA序列與原始菌株的序列分析比對等證明菌株在香蕉假莖具有內生定殖力。