HIV-1性傳播的關(guān)鍵分子DC-SIGN特異性表達(dá)機(jī)制研究.pdf

1、DC-SIGN(全稱為樹突狀細(xì)胞特異的胞間黏附分子-3捕獲非整合素，DC-Specific Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin)是樹突狀細(xì)胞(DC)表面重要的粘附分子受體，它可以誘導(dǎo)DC穿越內(nèi)皮層，并與ICAM-3結(jié)合介導(dǎo)DC與初始T細(xì)胞的聚集。此外，作為模式識別受體(PRR)，DC-SIGN能夠識別和介導(dǎo)多種病原體在人體內(nèi)的感染并誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，其中研究得最

2、為廣泛的是DC-SIGN與HIV-1性傳播的關(guān)系。生殖道粘膜下DC表面的DC-SIGN可以和HIV-1 gp120蛋白高親和力結(jié)合，將HIV-1吞飲進(jìn)入胞漿，被保存在胞內(nèi)小體里，使其感染性維持長達(dá)7天之久，并且逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。這些HIV-1保持了很強(qiáng)的感染性，通過DC的遷移到達(dá)引流淋巴結(jié)，并高效率地感染CD4+T細(xì)胞。因此，DC-SIGN在HIV性傳播中可能起著決定性的作用。
　　 DC-SIGN之所以在HIV-1性傳播中有

3、如此重要的作用，還與它的組織和細(xì)胞特異性表達(dá)有關(guān)。DC-SIGN在體內(nèi)的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，表達(dá)范圍非常局限，DC-SIGN特異性地高表達(dá)于HIV-1性傳播密切相關(guān)的組織和細(xì)胞上。研究發(fā)現(xiàn)，DC-SIGN在體內(nèi)的特異性表達(dá)是受IL-4等細(xì)胞因子誘導(dǎo)的，但是目前DC-SIGN的這種特異性表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚，鑒于DC-SIGN在HIV-1性傳播中的重要性，研究DC-SIGN的特異性表達(dá)調(diào)控機(jī)制十分必要。真核細(xì)胞基因的特異性表達(dá)主要由啟

4、動子的活性決定，在本課題中，我們從DC-SIGN啟動子入手，研究了其順式作用元件在DC-SIGN啟動子活性中的作用；然后以IL-4誘導(dǎo)THP-1表達(dá)DC-SIGN為模型，研究了參與DC-SIGN特異性表達(dá)的上游信號通路，初步探索了DC-SIGN特異性表達(dá)的調(diào)控機(jī)制；最后探討了DC-SIGN啟動子與HIV-15’LTR活化的關(guān)系。
　　 我們首先以pGL-3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)為主要研究工具，用PCR法擴(kuò)增得到DC-SIGN啟動子

5、序列，并通過定點(diǎn)突變的方法得到AP-1和Ets-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失的DC-SIGN啟動子，重組到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒內(nèi)，轉(zhuǎn)染293T、Hacat和THP-1三種細(xì)胞，通過檢測熒光素酶活性來反映DC-SIGN啟動子的活性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DC-SIGN的啟動子在不同細(xì)胞株中活性不同，在THP-1細(xì)胞中活性最強(qiáng)，表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞學(xué)特異性；AP-1結(jié)合位點(diǎn)缺失可以部分降低DC-SIGN啟動子的活性(下降達(dá)11.85％～75.25％不等)，Ets

6、-1結(jié)合位點(diǎn)缺失對DC-SIGN啟動子活性的影響比AP-1位點(diǎn)顯著，使DC-SIGN啟動子活性幾乎消失(下降達(dá)90％以上)。說明Ets-1結(jié)合位點(diǎn)在DC-SIGN啟動子的活化中起主要作用。
　　 我們進(jìn)一步研究了激活DC-SIGN啟動子的上游信號通路。我們采用IL-4誘導(dǎo)PMA刺激的THP-1細(xì)胞這一DC-SIGN的體外表達(dá)模型，從mRNA、胞漿和細(xì)胞表面蛋白表達(dá)三個(gè)水平檢測了THP-1細(xì)胞上DC-SIGN的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

7、IL-4可以大幅提高DC-SIGN在THP-1細(xì)胞上的表達(dá)，是調(diào)節(jié)DC-SIGN特異性表達(dá)的重要調(diào)控因子。我們選取IL-4受體的JAK-STAT和ERK信號通路，以及NF-κB和p38信號通路為目的信號通路，先采用特異的阻斷劑阻斷信號通路，檢測DC-SIGN的表達(dá)，再通過檢測信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平來反映信號通路的活化。結(jié)果顯示，在mRNA、胞漿和細(xì)胞表面蛋白表達(dá)三個(gè)水平上，ERK通路阻斷劑阻斷效果最好，幾乎完全阻斷了IL-4的誘導(dǎo)

8、效果，JAK-STAT和NF-κB通路阻斷劑具有部分阻斷效果，而p38通路阻斷劑無阻斷效果。信號蛋白磷酸化檢測結(jié)果顯示，ERK、JAK-STAT和NF-κB通路均被激活。該部分研究顯示，DC-SIGN表達(dá)是一個(gè)多信號通路參與的過程，其中以ERK通路為主，JAK-STAT和NF-κB通路共同參與，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　 最后，我們通過pGL-3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)，比較研究了不同信號通路阻斷劑對DC-SIGN啟動子和HIV

9、-15’LTR的活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-4激活的信號通路對HIV-15’LTR也具有活化作用，NF-κB和ERK信號通路參與了HIV-15’LTR的活化。為研究性傳播途徑中HIV-1感染與DC-SIGN表達(dá)的相互促進(jìn)奠定了基礎(chǔ)，也為潛伏感染的HIV-1前病毒的活化提供了新的思路。
　　 綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)Ets-1結(jié)合位點(diǎn)在DC-SIGN啟動子的活化中起主要作用；
　　 (2)ERK信號通路是

10、IL-4誘導(dǎo)DC-SIGN表達(dá)過程中的主要信號通路，并發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路也參與了IL-4誘導(dǎo)的DC-SIGN的表達(dá)過程；
　　 (3)首次對HIV-15’LTR與DC-SIGN啟動子活性進(jìn)行了對比研究，發(fā)現(xiàn)IL-4激活的信號通路對HIV-15’LTR也具有活化作用。
　　 本課題首次對DC-SIGN的特異性表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了從啟動子到上游信號通路的系統(tǒng)性的專門研究，初步揭示了HIV-1性傳播的關(guān)鍵分子DC-SIGN的