新型原位聚合酶鏈反應在檢測肝組織中HBV cccDNA的臨床應用價值研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是呈世界性流行,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球大概有3.5億 HBV攜帶者,其中約有10％發(fā)展為慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)進而發(fā)展為肝硬化、肝衰竭以及原發(fā)性肝癌等嚴重的并發(fā)癥,每年約有28萬人死于HBV感染相關性疾病[1]。
　　HBV cccDNA又稱乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀 DNA,是HBVDNA復制的中間體,亦是HBV前基因RNA

2、復制的模板,只有徹底清除HBV cccDNA,才能真正清除乙肝病毒,因此HBV cccDNA的檢測對研究乙型肝炎致病機制和評價抗病毒藥物的療效及新藥的研發(fā)等方面具有重要的意義。利用PSAD(質(zhì)粒安全ATP依賴DNA酶)消化、原位滾環(huán)擴增(RCA)等方法進行原位 PCR檢測肝組織中的 HBV cccDNA是目前來說較新的一種原位 PCR方法,與液相PCR相比不需從肝組織中提取DNA只需在組織切片上即可進行原位擴增,與southern相比,

3、不需要電泳、轉(zhuǎn)膜等一系列復雜的操作步驟,與原位雜交相比,可以將低拷貝的HBV cccDNA通過擴增檢測出來,與傳統(tǒng)的一步原位PCR方法相比較,由于經(jīng)過PSAD消化處理去除了非cccDNA的影響以及原位RCA只擴增cccDNA,再加上特異性標記跨的缺口引物擴增,使敏感性和特異性均得到了提高,而且還可以在分子水平上將組織形態(tài)與基因定位、分布狀態(tài)較好地聯(lián)系起來,還可進一步了解HBVDNA的復制能力,不但可以為臨床抗病毒治療提供指導,而且為乙型

4、肝炎的病理學研究提供了適宜的手段。
　　目的:利用新型原位聚合酶鏈反應檢測肝組織中的HBV cccDNA,明確 HBV cccDNA在肝組織中的分布狀況,為進一步研究 HBV cccDNA在乙型肝炎的致病機制及探討乙肝治療的新途徑提供分子病理學基礎。
　　方法:
　　1、收集30例乙型肝炎、乙肝后肝硬化及肝癌患者的石蠟包埋組織切片,采用同一石蠟包埋肝組織連續(xù)切片進行 HE染色,并對染色結(jié)果進行炎癥活動度與肝纖維化程度分

5、級分期,并對每一個石蠟包埋的肝組織進行HBsAg和HBcAg免疫組織化學染色.
　　2、將肝組織切片進行防脫及通透化處理后采用PSAD消化,為證明PSAD的作用,我們將切片PSAD消化前后采取同一種擴增方法的兩張切片進行對比,通過對有無PSAD消化的兩種原位PCR對比,來突出本方法的優(yōu)勢,證明PSAD去除松弛的環(huán)狀HBVDNA及其他形式的DNA,從而增加了檢測的特異性。
　　3、為進一步驗證滾環(huán)擴增的效果,取兩張同一肝組織連

6、續(xù)切片分別進行PSAD酶消化后采用半套式原位PCR檢測和滾環(huán)擴增加上跨缺口的原位PCR檢測,對兩種方法的圖像結(jié)果進行對比分析,評價兩種方法的敏感性與特異性,從而判斷新型原位PCR方法的敏感性和特異性,探討其應用價值。
　　結(jié)果:
　　1、30例HBV感染患者組織切片病理學分級、分期為G1-4S0-4,診斷為慢性乙型肝炎23例、肝硬化患者1例,肝癌患者6例;免疫組化HBsAg,陽性為26例,HBcAg,陽性為18例
　　

7、2、應用新型原位PCR檢測肝組織中HBV cccDNA,30例組織切片有20例為HBV cccDNA陽性,陽性檢出率67%,組織切片陽性表達率為平均35%-70%。以核型為主,呈藍色、紫色或紫藍色,呈顆粒狀、弧形或圓形團塊狀,主要在核及核膜上分布。
　　3、將切片 PSAD消化前后采取同一種擴增方法的兩張同一肝組織切片進行對比發(fā)現(xiàn)使用 PSAD消化的切片,擴增的 HBV cccDNA陽性顆粒較明顯,未使用PSAD消化的肝組織切片上

8、擴增的陽性顆粒不明顯,說明 PSAD去除了部分非 cccDNA的干擾,使特異性和敏感性均得到了提高。
　　4、應用新型原位PCR檢測肝組織中HBV cccDNA與同一連續(xù)切片的半套式原位PCR方法相比,擴增的基因點較集中,顆粒擴散范圍較小,因此特異性更高。與傳統(tǒng)的一步原位PCR相比,新型原位PCR能檢測到傳統(tǒng)原位PCR檢測不到的HBV cccDNA陽性顆粒,因此敏感性更強。
　　5、陰性患者及陰性對照肝細胞胞核為紅色,未見

9、HBVcccDNA陽性顆粒。
　　6、總計30例檢測患者中,6例慢性乙型肝炎患者、1例酒精性肝硬化合并乙肝肝硬化靜止期的患者、1例肝癌和1例乙肝慢性重癥患者的組織切片中出現(xiàn) HBVcccDNA強陽性信號,慢性乙肝輕型和慢性乙肝中度患者組織細胞陽性表達率明顯低于乙肝慢性重癥、肝硬化和肝癌病。
　　7、 HBcAg陽性的肝組織切片檢測HBV cccDNA結(jié)果均為陽性。
　　8、肝組織中 HBV cccDNA陽性結(jié)果的出現(xiàn)與