MsrB1(SelR)對過氧亞硝酸根誘發(fā)人晶狀體上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、白內(nèi)障特別是老年性白內(nèi)障是人類致盲的主要眼疾,嚴(yán)重影響人的生活質(zhì)量。據(jù)推測,如能使白內(nèi)障的發(fā)生推遲10年,白內(nèi)障的手術(shù)會下降45％。因此,開展白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理和預(yù)防研究是一個(gè)十分重要的課題。
　　白內(nèi)障的致病因子很多,病理復(fù)雜,但都與氧化應(yīng)激導(dǎo)致晶狀體的損傷相關(guān)。過氧亞硝酸根(ONOO)作為一個(gè)強(qiáng)的生物氧化劑和硝化劑,與各種生物大分子反應(yīng),引起脂質(zhì)過氧化、DNA損傷和蛋白質(zhì)氧化硝化,可能是白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要方面。一些證據(jù)表明必

2、需微量元素硒對眼起重要的保健作用,其中,硒蛋白R(SelR)也稱蛋氨酸亞砜還原酶(Msr)B1在維持眼晶狀體透明中的作用,受到人們的關(guān)注。然而,MsrB1對ONOO誘發(fā)晶狀體上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,特別是其對晶狀體細(xì)胞分化中信號通路分子損傷的保護(hù)作用鮮見報(bào)道。
　　本論文以人晶狀體上皮(hLE)細(xì)胞SRA01/04為研究對象,探討了MsrB1對hLE細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的機(jī)理,主要結(jié)果如下:
　　(1)MsrB1對ONOO

3、誘導(dǎo)hLE細(xì)胞凋亡的抑制作用。
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、MTT法、蛋白質(zhì)印跡、熒光顯微鏡、透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)等方法研究了MsrB1對ONOO誘導(dǎo)的hLE細(xì)胞凋亡以及氧化還原平衡的調(diào)節(jié)。結(jié)果表明低濃度的ONOO可以刺激hLE細(xì)胞增殖,而高濃度的ONOO明顯導(dǎo)致hLE細(xì)胞死亡的增加。單獨(dú)的ONOO處理或MsrB1基因沉默都可以誘導(dǎo)hLE細(xì)胞中氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,激活caspase-3,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。當(dāng)MsrB1基因沉

4、默細(xì)胞經(jīng)300μMONOO處理后,使氧化應(yīng)激水平、DNA斷裂水平、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度以及caspase-3活性進(jìn)一步增加,從而加劇了hLE細(xì)胞的凋亡和死亡。以上研究結(jié)果表明,MsrB1在抑制ONOO導(dǎo)致的氧化應(yīng)激,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡和緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起著重要的作用,且MsrB1也可以通過抑制caspase-3的激活和DNA的氧化損傷保護(hù)hLE細(xì)胞抵抗由ONOO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。我們的結(jié)果提示MsrB1正?；钚缘膩G失可能有助于白內(nèi)障

5、的發(fā)生。
　　(2)MsrB1對ONOO誘導(dǎo)hLE細(xì)胞F-actin損傷的保護(hù)作用。
　　F-actin是細(xì)胞骨架的重要組成部分,在基本的細(xì)胞分裂、遷移和分化等過程中起著至關(guān)重要的作用。采用蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、信號通路抑制劑處理以及免疫熒光等方法研究了MsrB1對ONOO誘導(dǎo)hLE細(xì)胞中F-actin損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明低濃度的ONOO?可以促進(jìn)F-actin的組裝,而高濃度的ONOO會損害F-actin的組裝,與此同

6、時(shí),伴隨著ERK1/2激活和ERK1/2抑制。高濃度的ONOO?作用于MsrB1基因沉默的細(xì)胞加劇了細(xì)胞中F-actin的去組裝和ERK的失活,進(jìn)一步的研究顯示F-actin的去組裝伴隨著F-actin蛋白硝化水平的增加,bFGF是通過MEK依賴性途徑激活ERK1/2的磷酸化,而ONOO是通過MEK非依賴性途徑激活的ERK1/2磷酸化。以上結(jié)果表明MsrB1可能通過抑制ONOO對F-actin蛋白的硝化和ERK的失活,保護(hù)hLE細(xì)胞避免

7、ONOO誘導(dǎo)的F-actin的損傷,提示MsrB1活性的丟失可能會對晶狀體細(xì)胞的增殖和分化造成影響。
　　(3)MsrB1對BCS誘導(dǎo)的hLE細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)。
　　采用MTT法、Cu/Zn-SOD試劑盒、熒光分光光度計(jì)、熒光顯微鏡和蛋白質(zhì)印跡等方法研究了MsrB1對銅離子螯合劑BCS誘導(dǎo)的hLE細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果表明1000μMBCS處理細(xì)胞后,Cu/Zn-SOD活性顯著下降,伴隨著hLE細(xì)胞內(nèi)活性氧的累積,

8、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和死亡的發(fā)生。單獨(dú)的MsrB1基因沉默會誘導(dǎo)hLE細(xì)胞ROS水平的顯著增加,從而激活細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制,誘導(dǎo)Cu/Zn-SOD活性增加。而BCS作用于MsrB1基因沉默的細(xì)胞,則進(jìn)一步增加胞內(nèi)ROS水平以及細(xì)胞凋亡和死亡。蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果表明,BCS作用于MsrB1基因沉默細(xì)胞,誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加與ERK磷酸化水平的下降有關(guān),這可能與BCS導(dǎo)致SOD的活性下降,O2·得不到及時(shí)的清除,使得ONOO的生成增加有關(guān),導(dǎo)致ERK的硝