電針治療大鼠胃潰瘍模型的效應與肥大細胞的相關性研究.pdf

1、根據中醫(yī)經絡學說,耳為宗脈之所聚,六陽經都直接或間接地上耳前或耳中,六陰經則通過與陽經的絡屬關系,間接地與耳發(fā)生聯(lián)系。臟腑的生理或病理活動均可通過經絡反映于耳。足三里是胃經的合穴,也是下合穴,“合治內府”,是治療胃腑病的常用首選穴位,具有和胃健脾,降逆調中之功。大量臨床和動物實驗觀察均證實針刺“耳胃”穴及“足三里”穴對胃潰瘍有明顯療效。但其治療的作用機理至今尚未甚明,以致影響防治效果。
　　 目的:研究電針“耳胃”及“足三里”穴

2、治療實驗性胃潰瘍過程中,穴區(qū)肥大細胞(mast cells,MCs)和腹腔MCs(Peritoneal MCs,PMCs)的功能變化與療效的相關性。
　　 方法:實驗均采用清潔級Wistar大鼠,雌雄各半,由中國醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。
　　 ①形態(tài)學及電生理學實驗:將40只大鼠(體重150-220g)隨機分為對照組、模型組、電針組和模型測導電量組(簡稱導電量組)。后3組首先采用1ml注射器在胃竇前壁肌層與漿膜層之間

3、注入0.05ml20％冰醋酸的方法制作胃潰瘍模型。電針組動物在手術后4h電針(2/15HZ,1mA,30min)雙側“耳胃”穴和“足三里”穴,電針前用HB-EDT-A穴位診斷治療儀(河北威海醫(yī)用電子儀器有限公司)測定1次“耳胃”穴導電量,然后隔2h再測定1次。以后每天電針前測定1次,至造模后7d。導電量組大鼠在胃潰瘍造模術后不進行電針,但耳穴測定與電針組同時進行。7天后分別取4組大鼠“耳胃”及“足三里”穴區(qū)組織恒冷箱切片,乙酰膽堿酯酶(

4、acetylcholinesterase,AchE)組化染色并用甲苯胺蘭(toluidine blue,TB)復染,顯示穴區(qū)真皮至皮下組織MCs的分布、數(shù)量和脫顆粒情況。取胃竇前壁含潰瘍胃組織石蠟包埋,切片后行蘇木精一伊紅(hemotoxylin-eosin,HE)染色。
　　 ②PMCs的收集和培養(yǎng)及流式細胞儀檢測:
　　 a PMCs的收集及離心:40只大鼠(體重約200g)經麻醉,腹部去毛,消毒后,切開腹部,在無菌

5、條件下收集腹腔沖洗液,并離心(1000r/min,4℃)10min,棄上清液,取其細胞懸液,沿管壁緩慢加入盛有PMCs分離液的離心管中,使兩液形成界面,然后離心(2500r/min,4℃)15min,棄上清液,取底部PMCs,用冷的無Ca2+、Mg2+的PBS離心清洗2次(1000r/min4℃)共20min,棄上清液。
　　 b PMCs的培養(yǎng)和血清的制備:取底部PMCs,TB染色,光鏡下計數(shù),調PMCs濃度至106個/ml,

6、PMCs純度大于95％以上,臺盼藍染色,活力大于95％,并置于含10％小牛血清的RPMI-1640孵育液中懸浮備用
　　 將30只大鼠(體重約200g)隨機分為對照組、模型組和電針組(3組大鼠的相應處理均按照形態(tài)學實驗中的方法,但電針組不再測耳穴導電量),7天后分別在3組大鼠的頸動脈取血,將血液移入離心管中,37℃下靜置2h,在常溫下離心(2500r/min)10min,用吸管小心吸取血清,將同組血清混合,過濾除菌,分裝后-20

7、℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　 c PMCs脫顆粒率的流式細胞儀分析:在PMCs懸液中,分別加入3組大鼠的血清(PMCs懸液與血清之比為1:1),置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內共孵育2h,4℃終止反應,用冷的無Ca2+、Mg2+的PBS離心清洗2次(1000r/min4℃)共10min,棄上清液,取底部PMCs,用100μl Anncxin-V熒光標記液(1ml孵育緩沖液+20μlAnncxin-V熒光標記素+20μl Propidium碘化

8、液)懸浮,并在15-25℃孵育10-15min,采用ELITE-型流式細胞儀計數(shù)Annexin V熒光陽性細胞數(shù)(即為PMCs的脫顆粒率)。
　　 結果:
　　 ①形態(tài)學實驗:對4組大鼠的穴區(qū)真皮至皮下組織MCs進行對比觀察,其中模型組MCs總數(shù)量均明顯多于導電量組、電針組和對照組,導電量組MCs總數(shù)量又明顯多于電針組和對照組,電針組又多于對照組。統(tǒng)計學處理結果顯示,4組間存在非常顯著性差異(P<0.01,P<0.01,

9、P<0.01)。通過對各組穴區(qū)內MCs脫顆粒率進行統(tǒng)計學處理,結果表明模型組MCs脫顆粒率明顯高于導電量組、電針組和對照組,導電量組細胞脫顆粒率也明顯高于電針組和對照組,電針組高于對照組,且4組間均存在非常顯著性差異(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。
　　 HE染色結果顯示:對照組胃竇前壁粘膜面完整無缺損；而模型組胃竇前壁粘膜面有很明顯的潰瘍缺損,已明顯超過粘膜肌層；電針組胃竇前壁粘膜面稍有缺損,尚未達粘膜肌層；導電

10、量組胃竇前壁粘膜面的潰瘍缺損介于模型組與電針組之間。
　　 ②電生理學實驗:導電量組及電針組大鼠術后“耳胃”穴導電量皆較手術前顯著升高,電阻值降低。但電針組于第1次電針后導電量即不再升高,維持在術后第1次測定的水平；導電量組大鼠術后耳穴導電量卻繼續(xù)升高,并持續(xù)3～5天,第6天后開始下降；兩組的耳穴導電量升高從第1次電針后即表現(xiàn)出組間顯著性差異,第7天后才逐漸接近。
　　 ③PMCs脫顆粒率的流式細胞儀檢測:模型血清組PM

11、Cs的脫顆粒率明顯高于電針血清組和對照血清組,電針血清組PMCs的脫顆粒率明顯高于對照血清組,統(tǒng)計學處理結果顯示3組間均有非常顯著性差異(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。
　　 結論:
　　 ①在穴區(qū)MCs較多,并多沿神經和血管分布,特別在小血管周圍較密集,說明MCs確實與穴位反應和針刺效應相關。
　　 ②相關穴區(qū)MCs數(shù)量及脫顆粒率的變化與實驗性胃潰瘍的發(fā)生呈正相關性,這為體表臟腑相關的理論提供實驗