誘導多功能干細胞(iPS)對小鼠下肢缺血再灌注損傷的保護作用研究.pdf

1、誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）是一種新型干細胞，系經轉入4個特定的轉錄因子(Oct3/4，Sox2，Klf4、c-Myc)到小鼠或人的體細胞，誘導其重編程為未分化的多能細胞。它可分化成內皮細胞、平滑肌細胞和外膜細胞，通過移植hiPSCs衍生的這些細胞可以促進血管和肌肉的再生。針對局部缺血損傷，iPS細胞發(fā)揮其作用依賴于其定向富集于損傷部位。
　　目的：本工作擬在i

2、PS細胞，研究miNA對iPS細胞的遷移、黏附影響；建立小鼠急性下肢缺血再灌注損傷缺血模型，觀察iPS細胞是否對下肢缺血再灌注損傷有保護作用。
　　方法：我們在成功制備出誘導多功能干細胞的前提下進行研究。首先體外研究：向iPS細胞轉染consiRNA和miRNA217觀察轉染后的iPS細胞遷移粘附的情況。體外：以C57BL/6J，8-10周齡雄性小鼠，制作小鼠下肢缺血再灌注損傷模型，右下肢作為對照組，分別在術后當天和第二天從尾靜脈

3、注射pbs、ips、mef（胚胎成纖維細胞）、controlsiRNA+ips、miRNA-217+ips6?104個/只/次/200ul.。細胞事先用紅色熒光染料處理，觀察72h后取材。
　　結果：⑴參照Yamanaka方法成功制備出誘導性多功能干細胞。⑵給予miRNA-217刺激iPS細胞后，對 iPS細胞的遷移能力無明顯影響。⑶在急性小鼠缺血再灌注損傷模型，觀察到ips形態(tài)呈梭形,ips細胞可以歸巢到缺血/再灌注損傷的股動脈

4、血管內膜。⑷缺血再灌注損傷小鼠尾靜脈注射 ips細胞或 MEF后28天，小鼠組織器官均無肉眼可見的腫瘤發(fā)生。⑸尾靜脈注射iPS細胞組較PBS和MEF組下肢缺血損傷側肢體的血流灌注明顯改善（*P<0.05），而經Lipo2000和miRNA-217預處理的 iPS組較單獨注射iPSCs組的治療效果明顯下降（*P<0.05）。⑹在損傷的后肢組織HE染色顯示：iPS細胞組肌細胞核數(shù)量明顯多于MEF、PBS、con-siRNA+iPS和mirR

5、NA-217組，后4組的細胞數(shù)量、形態(tài)無明顯差異（n=9）。⑺DiI(呈紅色熒光)標記的 iPS細胞的定位顯示，iPS組較consiRNA+iPS組和miRNA-217+iPS2組小鼠損傷組織中陽性細胞數(shù)明顯多（P<0.05）。⑻CD31免疫熒光化學方法檢后肢缺血再灌注損傷部位小鼠肌肉組織血管的改變情況：陽性計數(shù)在PBS、MEF、iPS、con-siRNA+iPS、miRNA217+iPS5組間比較無統(tǒng)計學差異。⑼實時PCR檢測顯示：注

6、射iPS和con-siRNA-iPS組在各個基因中的變化趨勢一致。在iPS、con-siRNA-iPS、miR-217-iPS3個組的IL-1βmRNA表達水平比PBS(1±0.24)和MEF(0.86±0.4)明顯升高，有統(tǒng)計學差異。IL-2mRNA在iPS組的表達明顯高于其余4組。TNF-α和MCP-1基因在iPS組表達水平最低，與其余4組比較均有統(tǒng)計學差異。IGF-1表達水平在 iPS、con-siRNA-iPS，miR-217-

7、iPS3個組中的表達水平均較 PBS和MEF組高（P<0.05）。其余基因在各組之間比較無統(tǒng)計學差異。⑽Teto定量：IPS細胞組的總DNA中Teto含量最高，與PBS組和MEF組比，iPS細胞組和miRNA217+iPS細胞組有顯著性差異（*P<0.05）；與其他細胞組相比，IPS細胞組 Teto含量明顯多（*P<0.05）。
　　結論：iPS細胞可定向歸巢到缺血/再灌注損傷部位，本實驗劑量6104個/只/次/200ul下無成瘤