子宮內(nèi)膜干細(xì)胞生物蛋白制劑對小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用.pdf

1、目的：闡明子宮內(nèi)膜干細(xì)胞（endometrial stem cells，EnSCs）來源細(xì)胞因子“雞尾酒”（EnSCs derived cytokine cocktail，EdCC）的心肌保護效應(yīng)與MEK/ERK信號通路的關(guān)系。
　　方法:用人的EnSCs于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液，以后每3d換液，生長融合達(dá)70%左右時進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第三代，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定 EnSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，然

2、后通過 Millipore技術(shù)從培養(yǎng)的EnSCs上清液中獲得EdCC，蛋白定量后供實驗用或－80℃冰箱儲存。用ELISA檢測 EnSCs原培養(yǎng)液中EGF，以結(jié)扎冠狀動脈前降支的方式制備心肌缺血再灌注損傷模型。根據(jù)實驗需要通過小鼠尾靜脈注射不同劑量或不同凍存時間的EdCC及相應(yīng)對照組試劑，再灌注24小時后用TTC/Evans blue染色小鼠I/R心肌，用image pro軟件計算其梗死面積。以7um厚度冰凍切片留樣，采用TUNEL染色和

3、免疫熒光染色方法檢測其細(xì)胞凋亡情況，用Western blot檢測ERK1/2磷酸化水平和cleaved caspase-3表達(dá)。乳小鼠心肌細(xì)胞分為正常組、對照組和EdCC組，用過氧化氫(H2O2)造成氧化應(yīng)激，檢測上清液乳酸脫氫酶(LDH)活性，同樣用TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡，DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧族(ROS)濃度。
　　結(jié)果：1、體外培養(yǎng)的EnSCs貼壁生長，呈紡錘形，融合后形成旋渦樣結(jié)構(gòu)。經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)分析,EnSC

4、s表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90，不表達(dá) CD34和CD45造血細(xì)胞來源表面標(biāo)志;用Millipore蛋白超濾技術(shù)可截留近90%EnSCs上清液中的EGF蛋白；2、每15ml EnSCs上清液經(jīng)Millipore超濾技術(shù)超濾濃縮后的體積為(200.5±11.2)μl，蛋白濃度為(5.57±0.95)μg/μl,EdCC的提取效率為每24h(222.4±29.3)μg/106細(xì)胞。3、－80℃長期儲存可導(dǎo)致 EdCC蛋白濃度及總量逐漸降

5、低；4、EdCC可以保護乳小鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激所致細(xì)胞損傷及凋亡；5、EdCC減輕小鼠缺血再灌注損傷注射100μg為最佳劑量；5、－80℃長時間儲存降低EdCC心肌保護效應(yīng)；6、EdCC可促進心肌ERK1/2磷酸化；7、EdCC介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化可被PD98059阻斷；8、EdCC通過MEK1-ERK信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷；9、EdCC通過MEK1-ERK信號通路抑制細(xì)胞凋亡10、EGFR部分參與EdCC的心肌保護作用。<