大鼠尺神經(jīng)和肌皮神經(jīng)再生時(shí)神經(jīng)纖維代償性放大規(guī)律的比較研究.pdf

1、臨床發(fā)現(xiàn)，尺神經(jīng)重建手術(shù)效果不如肌皮神經(jīng)，在供體神經(jīng)纖維數(shù)量不足時(shí)更加明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，不同神經(jīng)在供體神經(jīng)纖維不足時(shí)，其神經(jīng)纖維代償性放大潛能不同。因此，我們假設(shè)尺神經(jīng)纖維的放大潛能不如肌皮神經(jīng)。本課題將通過研究尺、肌皮神經(jīng)在其再生過程中神經(jīng)代償性放大效應(yīng)差異及其影響因素，驗(yàn)證我們提出的假設(shè)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果從神經(jīng)再生角度闡釋尺神經(jīng)重建手術(shù)不如肌皮神經(jīng)的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)分成三部分:(1)明確大鼠尺、肌皮神經(jīng)在臂叢神經(jīng)根的定量分布，其目的是采用穩(wěn)

2、定、可操作性強(qiáng)的方法，減少尺、肌皮神經(jīng)中的神經(jīng)纖維數(shù)量，從而建立可供研究尺、肌皮神經(jīng)再生代償性放大潛能差異的大鼠模型。(2)比較大鼠尺、肌皮神經(jīng)再生時(shí)神經(jīng)纖維代償性放大極限。(3)通過Real-timePCR檢測(cè)神經(jīng)縫合口遠(yuǎn)端神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，分析其表達(dá)量與神經(jīng)纖維再生代償性放大率的關(guān)系。
　　第一部分建立研究尺、肌皮神經(jīng)再生時(shí)神經(jīng)纖維代償性放大極限的大鼠模型
　　目的: 通過True-Blue、Fluo-Emerald、

3、Fluo-Ruby三種熒光劑逆行示蹤，比較三種熒光劑染色的可靠性和穩(wěn)定性。明確支配尺、肌皮神經(jīng)的神經(jīng)元在臂叢神經(jīng)根的分布及支配比例，并采用切斷某些神經(jīng)根以減少尺、肌皮神經(jīng)中的神經(jīng)纖維數(shù)量，從而建立可供研究尺、肌皮神經(jīng)再生代償性放大潛能差異的大鼠模型。
　　方法: 60只成年健康清潔級(jí)雌性SD大鼠，體重150-200克，隨機(jī)分成6組，每組10只:U-TB組為尺神經(jīng)True-Blue示蹤組;U-FE組為尺神經(jīng)Fluo-Emerald示

4、蹤組;U-FR組為尺神經(jīng)Fluo-Ruby示蹤組。M-TB組為肌皮神經(jīng)True-Blue示蹤組;M-FE組為肌皮神經(jīng)Fluo-Emerald示蹤組;M-FR組為肌皮神經(jīng)Fluo-Ruby示蹤組。分析支配尺神經(jīng)和肌皮神經(jīng)的神經(jīng)元在脊髓的分布和各神經(jīng)根支配比例，以及三種熒光劑染色定量結(jié)果的穩(wěn)定性。每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，各組間的差異采用單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)值設(shè)定為0.05。
　　結(jié)果: (1) U-TB組:顯示著藍(lán)色的神經(jīng)元

5、位于C7-T1脊髓前角和相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)，總數(shù)為2176±186.51。其中位于C7前角的數(shù)量為5.2±2.44個(gè)（0～9個(gè)），背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為31±11.32個(gè);位于C8前角的數(shù)量為157±29.8個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為1203.1±113.71個(gè);位于T1前角的數(shù)量為150±21個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為651.3±78.47。C5、6未見染色神經(jīng)元。(2) U-FE組:顯示著綠色的神經(jīng)元位于C7-T1的脊髓前角和相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)，總數(shù)為2268.7

6、±209.57。其中位于C7前角的數(shù)量為5.6±2.41個(gè)（0～8個(gè)），背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為34±7.73個(gè);位于C8前角的數(shù)量為150±19.9個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為1305±194.8;位于T1前角的數(shù)量為142.4±26.25.個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為631.2±43.92個(gè)。C5、6未見染色神經(jīng)元。(3) U-FR組:顯示著紅色神經(jīng)元位于C6-T1節(jié)段脊髓前角和相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)，總數(shù)為2216±211.56。其中位于C6前角的數(shù)量為0個(gè)，背根神經(jīng)

7、節(jié)內(nèi)為0～55個(gè);位于C7前角的數(shù)量為4.4±2.22個(gè)（2～9個(gè)），背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為28.6±11.79;位于C8前角的數(shù)量為135±23.9，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為1224.5±148.74.個(gè);位于T1前角的數(shù)量為153.9±18.19，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為669.7±97.42個(gè)。(4) M-TB組:顯示著藍(lán)色的神經(jīng)元位于C4-C7的脊髓前角和相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)，總數(shù)為1871±120.53。其中位于C4前角的數(shù)量為0～11個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為7.8

8、±4.05個(gè);位于C5前角的數(shù)量為164±16.97個(gè)，背根內(nèi)為253.3±36.96個(gè);位于C6前角的數(shù)量為149±25.8個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為904.6±104.92;位于C7前角的數(shù)量為0～6個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)為386.5±28.77個(gè)。C8、T1脊髓節(jié)段未見染色神經(jīng)元。(5) M-FE組:顯示著綠色的神經(jīng)元位于C5-C7的脊髓前角和相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)，總數(shù)為1937.9±311.22。其中位于C5前角的數(shù)量為171.2±49.31個(gè)，背根

9、神經(jīng)節(jié)內(nèi)為244.4±25.49個(gè);位于C6前角的數(shù)量為143±28.6個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為985.1±257.57;位于C7前角的數(shù)量為0～7個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)為291.7±51.36個(gè)。C4、C8、T1脊髓節(jié)段未見染色神經(jīng)元。(6) M-FR組:顯示著紅色的神經(jīng)元位于C4-C8的脊髓前角和相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)，總數(shù)為1902±212.64。其中位于C4前角的數(shù)量為0～12個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為0～15個(gè);位于C5前角的數(shù)量為151.8±18.38個(gè)

10、，背根神經(jīng)節(jié)為240±30.4;位于C6前角的數(shù)量為132.7±16.64個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)為947±203個(gè);位于C7前角的數(shù)量為0～15個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為412.6±46.94個(gè);位于C8前角的數(shù)量為0～2個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)為0～4個(gè)。T1脊髓節(jié)段未見染色神經(jīng)元。(7)本實(shí)驗(yàn)中，在三種不同熒光素染色標(biāo)記的條件下，尺、肌皮神經(jīng)在神經(jīng)根及其背根神經(jīng)節(jié)的分布及支配比例基本相同(P＞0.05)。以Fulo-emerald示蹤結(jié)果為基準(zhǔn)，尺神經(jīng)運(yùn)動(dòng)

11、神經(jīng)元主要位于C8和T1，兩個(gè)節(jié)段數(shù)量基本相同，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;感覺神經(jīng)元主要位于C7、8和T1，C8節(jié)段數(shù)量最多。T1運(yùn)動(dòng)、感覺神經(jīng)元總和約占支配尺神經(jīng)的神經(jīng)元總數(shù)的34.1％，C7占1.7，％，C8占約64.2％。肌皮神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元主要位于C5和C6，C5節(jié)段數(shù)量稍多;感覺神經(jīng)元主要位于C5-7，C6節(jié)段數(shù)量最多，C7主要含感覺神經(jīng)元。C5運(yùn)動(dòng)、感覺神經(jīng)元總和占支配肌皮神經(jīng)的神經(jīng)元總數(shù)的22.1％，C6占62.5％，C7占15.4％。

12、
　　結(jié)論: (1)采用切斷C5-8神經(jīng)根，保留T1神經(jīng)根，并將尺神經(jīng)切斷后行自身端-端縫合修復(fù)的方法建立大鼠模型，作為以尺神經(jīng)纖維代償性放大極限的模型是可靠的。(2)采用切斷C6-8、T1神經(jīng)根，保留C5神經(jīng)根，并將肌皮神經(jīng)切斷后行自身端-端縫合修復(fù)的方法建立大鼠模型，作為研究肌皮神經(jīng)纖維代償性放大極限的模型是可靠的。
　　第二部分大鼠尺、肌皮神經(jīng)再生時(shí)神經(jīng)纖維代償性放大極限的比較研究
　　目的: 通過動(dòng)態(tài)觀察尺、肌

13、皮神經(jīng)神經(jīng)再生過程中神經(jīng)纖維代償性放大率，比較這兩神經(jīng)的神經(jīng)纖維放大極限。
　　方法: 224只成年健康清潔級(jí)雌性SD大鼠，體重150～200克，隨機(jī)分成神經(jīng)放大模型16組，每組8只:U-1、2、3、4、8、12、16、20分別代表尺神經(jīng)放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周;M-1、2、3、4、8、12、16、20分別代表肌皮神經(jīng)放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周。以對(duì)側(cè)肢體相應(yīng)神經(jīng)為正常對(duì)照組。

14、切斷相應(yīng)神經(jīng)，設(shè)為神經(jīng)切斷對(duì)照組，每組6只。按時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)(1)神經(jīng)縫合口近、遠(yuǎn)端有髓神經(jīng)纖維數(shù)量，計(jì)算其放大率;縫合口近、遠(yuǎn)端的運(yùn)動(dòng)纖維數(shù)量，計(jì)算其放大率;(2)神經(jīng)CMAP波幅和潛伏期;(3)神經(jīng)纖維直徑、軸突直徑、髓鞘厚度、G比率。每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用單因素方差分析分析各組間的差異，統(tǒng)計(jì)值設(shè)定為0.05。
　　結(jié)果: (1)正常肌皮神經(jīng)、尺神經(jīng)纖維總量分別為2135±197和2535±238;運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維分別

15、為395±47和335±34。(2)尺神經(jīng)放大模型建立后1周至4周，縫合口近端神經(jīng)數(shù)量依次為653.23±102.71，703.79±84.26，772.40±54.93和593.41±39.36;縫合口遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維數(shù)量依次為979.72±162.73，972.35±93.30，1124.59±217.27和1980.33±216.53;放大率依次為2.20±0.53，1.41±0.24，1.57±0.39和3.34±0.51;建模后8

16、、12、16和20周，縫合口近端神經(jīng)纖維數(shù)量依次為725.92±132.93，671.80±112.25，553.52±64.71和682.51±107.42，遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維數(shù)量依次為2217.72±419.84，1677.29±254.92，1844.19±202.90和1953.13±412.17，放大率依次為3.01±0.44，2.76±0.37，3.15±0.46和2.31±0.98。(3)肌皮神經(jīng)放大模型建立后1周至4周，縫合口

17、近端神經(jīng)數(shù)量依次為352.75±40.31，393.49±59.27，379.81±60.52和350.61±30.58;縫合口遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維數(shù)量依次為1079.75±242.41，477.36±83.55，453.75±76.59和1434.77±312.93，放大率依次為4.77±1.25，1.21±0.47，1.19±0.32和4.09±0.73;建模后8、12、16和20周，縫合口近端神經(jīng)纖維數(shù)量依次為387.68±52.74，3

18、62.48±33.45，372.07±43.28和363.25±37.42，縫合口遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維數(shù)量依次1798.60±345.37，1566.19±217.04，1549.96±215.47和1479.31±174.58，放大率依次為4.71±1.32，4.29±0.79，4.23±0.65和4.34±0.49。(4)尺神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維:放大模型建立后1周至4周，縫合口近端運(yùn)動(dòng)纖維數(shù)量為212.61±43.82，192.43±27.55

19、，200.92±35.27和183.90±27.44，遠(yuǎn)端為20.55±7.13，12.38±4.31，19.39±7.30和20.09±7.59，放大比率分別為0.094±0.031，0.057±0.012，0.110±0.031和0.102±0.037。8周、12周、16周和20周的近端運(yùn)動(dòng)纖維數(shù)量為190.37±25.38，222.61±42.73，208.52±74.75和231.45±77.19，遠(yuǎn)端分別為120.59±37.

20、30，219.91±50.48，277.40±47.65和291.80±49.92，放大比率分別為0.72±0.169，1.06±0.242，1.48±0.45和1.45±0.317。(5)肌皮神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維:放大模型建立后1周至4周，縫合口近端運(yùn)動(dòng)纖維數(shù)量依次為235.41±32.70，229.74±61.53，202.72±55.09和199.61±28.78，縫合口遠(yuǎn)端的運(yùn)動(dòng)纖維數(shù)量分別為7.35±4.39，10.95±3.18

21、，19.57±7.02和40.60±9.17，放大率依次為0.031±0.0184，0.045±0.0287，0.091±0.0221和0.195±0.049;建模后8、12、16和20周，縫合口近端運(yùn)動(dòng)纖維數(shù)量依次為254.10±47.75，218.06±27.80，231.44±30.40和230.51±40.06，縫合口的遠(yuǎn)端運(yùn)動(dòng)纖維數(shù)量依次為180.57±41.50，290.82±49.52，289.53±44.47和277.4

22、9±46.59，放大率依次為0.774±0.216，1.26±0.35，1.36±0.27和1.209±0.411。(6)20周時(shí)肌皮神經(jīng)纖維直徑為5.76±1.21μm，軸突直徑為4.01±1.08μm，髓鞘厚度為0.72±0.24μm，G比率為0.73±0.12;尺神經(jīng)纖維直徑為4.28±0.84μm，軸突直徑為3.14±0.11μm，髓鞘厚度為0.53±0.19μm，G比率為0.62±0.09。(7)正常尺、肌皮神經(jīng)神經(jīng)的CMAP

23、的潛伏期分別為1.50±0.22 ms和1.24±0.27 ms。模型建立后的1-2周，未檢測(cè)到尺、肌皮神經(jīng)CMAP。正常尺神經(jīng)的波幅為6.77±1.62 mV;第3周開始，CMAP波峰逐漸增加。術(shù)后20周，波峰為4.14 mV，小于正常對(duì)照組(P＜0.05)。正常對(duì)照肌皮神經(jīng)的波幅為9.46±2.33 mV。3周時(shí)，波峰為1.32mV;第3周開始，CMAP波峰逐漸增加，至術(shù)后20周，波峰為7.97mV，與正常組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

24、＜0.05)。20周時(shí)，尺神經(jīng)CMAP波幅恢復(fù)率低于肌皮神經(jīng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論: 神經(jīng)纖維代償性放大模型建立后20周時(shí)，(1)尺神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維放大率與肌皮神經(jīng)相似，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞0.05;(2)尺神經(jīng)感覺纖維放大率小于肌皮神經(jīng)。(3)20周時(shí)尺神經(jīng)的神經(jīng)纖維直徑、軸突直徑和髓鞘厚度均小于肌皮神經(jīng)(P＜0.05)。(4)20周時(shí)尺神經(jīng)CMAP波幅、潛伏期恢復(fù)率低于肌皮神經(jīng)（P＜0.05）。
　　第三部分尺、肌

25、皮神經(jīng)再生代償性放大過程中遠(yuǎn)端神經(jīng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)與感覺纖維放大率的關(guān)系
　　目的: 分析神經(jīng)纖維放大模型中，尺、肌皮神經(jīng)縫合口遠(yuǎn)端BDNF、GDNF、CNTF和NGF的mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)與感覺纖維放大率的關(guān)系。
　　方法: 224只成年健康清潔級(jí)雌性SD大鼠，體重150～200克。分成16組，每組8只。U-1、2、3、4、8、12、16、20分別代表尺神經(jīng)放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周;M-1、2、

26、3、4、8、12、16、20分別代表肌皮神經(jīng)放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周。以對(duì)側(cè)肢體相應(yīng)神經(jīng)作為正常對(duì)照。各組設(shè)立6只大鼠，切斷相應(yīng)神經(jīng)，作為神經(jīng)切斷對(duì)照組。在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)，分別取縫合口遠(yuǎn)端尺、肌皮神經(jīng)，行Real-time PCR檢測(cè)BDNF、GDNF、CNTF和NGF四種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的mRNA拷貝量，并比較其在尺、肌皮神經(jīng)中的差異。
　　結(jié)果: (1)每組標(biāo)本中，mRNA含量均在0.1μg/mg以上。

27、其中U-1、U-2、U-3、U-4，以及M-1、M-2、M-3、M-4的總mRNA含量波動(dòng)在0.38～0.46μg/mg，多于正常對(duì)照組的mRNA含量(P＜0.0001)。術(shù)后8周及更長(zhǎng)時(shí)間組，各組總mRNA含量與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。(2)尺神經(jīng)纖維代償性放大模型組:①NGF mRNA:術(shù)后1、3、4周，神經(jīng)放大組、神經(jīng)切斷組表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，而前兩者之間無差異。4周以后的其余時(shí)間點(diǎn)，各組之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各個(gè)

28、組mRNA拷貝量均隨著手術(shù)后時(shí)間的推移而逐漸下降。②BDNFmRNA:在正常對(duì)照組，未檢測(cè)到BDNF mRNA;在神經(jīng)放大組，隨著時(shí)間推移，其拷貝量上升，3周時(shí)達(dá)到頂峰，之后逐漸下降，4周以后急劇下降，20周時(shí)檢測(cè)到低度表達(dá)。神經(jīng)切斷組改變類似于神經(jīng)放大組，但是處在一個(gè)更高的表達(dá)水平，在12周時(shí)較8周時(shí)輕微上升。③CNTF mRNA:在正常對(duì)照組各時(shí)間段均高度表達(dá)。神經(jīng)放大組在術(shù)后1周即出現(xiàn)明顯下降，以后其拷貝量逐漸上升，在術(shù)后的20周

29、達(dá)到頂峰，但低于正常對(duì)照組水平。神經(jīng)切斷組在術(shù)后1周，其值亦明顯下降，表達(dá)量穩(wěn)定。4周以后，神經(jīng)放大組CNTF mRNA的拷貝量多于神經(jīng)切斷組(P＜0.05)。④GDNF mRNA:在正常對(duì)照組，基本未檢測(cè)到GDNFmRNA表達(dá)。在神經(jīng)切斷組，其拷貝量1到3周表達(dá)穩(wěn)定，4周之后急劇下降。神經(jīng)放大組1到3周內(nèi)表達(dá)亦較穩(wěn)定，但表達(dá)水平低于神經(jīng)切斷組;8周開始明顯下降，20周時(shí)僅有極少量表達(dá)。4周后各時(shí)間點(diǎn)兩者之間無明顯差別。(3)肌皮神經(jīng)纖

30、維代償性放大模型組:①NGF mRNA:術(shù)后1、3周，神經(jīng)放大組表達(dá)量大于正常對(duì)照組;術(shù)后1、2、3周，神經(jīng)切斷組表達(dá)量大于正常對(duì)照組(P＜0.05);術(shù)后的2、3周神經(jīng)放大組表達(dá)量大于神經(jīng)切斷組(P＜0.05)。4周以后的其余時(shí)間點(diǎn)，各組之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各個(gè)組NGF mRNA拷貝量均隨著手術(shù)后時(shí)間的移而逐漸下降。②CNTF mRNA:在正常對(duì)照組各時(shí)間段均高度表達(dá)。神經(jīng)放大組在術(shù)后1周即出現(xiàn)明顯下降，下降比例在70％以上，之后隨

31、著時(shí)間的延長(zhǎng)，其拷貝量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，在術(shù)后20周達(dá)到頂峰，但依然低于正常對(duì)照組水平。神經(jīng)切斷組在術(shù)后1周，其值亦明顯下降，隨著失神經(jīng)支配時(shí)間延長(zhǎng)，未出現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。4周以后，神經(jīng)放大組CNTFm RNA的拷貝量多于神經(jīng)切斷組（P＜0.05）。③BDNF mRNA:在正常對(duì)照組，未檢測(cè)到BDNF的mRNA;在神經(jīng)放大組，其拷貝量逐漸上升，3周時(shí)達(dá)到頂峰，之后逐漸下降，8周以后僅少量表達(dá)，20周時(shí)已經(jīng)無法檢測(cè)。神經(jīng)切斷組改變類似于神經(jīng)

32、放大組，但是處在一個(gè)更高的表達(dá)水平。④GDNF mRNA:在正常對(duì)照組，未檢測(cè)到GDNF mRNA表達(dá)。在神經(jīng)放大組，其拷貝量從1周上升，之后下降;從8周開始急劇下降。1至12周內(nèi)，神經(jīng)切斷組的表達(dá)量均高于神經(jīng)放大組，16周后兩者之間無明顯差別。(4)尺、肌皮神經(jīng)模型組之間比較:①BDNFmRNA在各時(shí)間點(diǎn)遠(yuǎn)端尺神經(jīng)的表達(dá)量較肌皮神經(jīng)低(P＜0.05);②GDNFmRNA在各時(shí)間點(diǎn)，遠(yuǎn)端尺、肌皮神經(jīng)的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);

33、③NGFmRNA在建模后表達(dá)量均增加，3周后平緩下降。建模后的1到3周，其表達(dá)量在兩神經(jīng)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);4、8和12周時(shí)，遠(yuǎn)端尺神經(jīng)NGF mRNA表達(dá)量低于肌皮神經(jīng)(P＜0.05);④3周以后的各時(shí)間點(diǎn)，遠(yuǎn)端尺神經(jīng)的CNTFmRNA表達(dá)量均較肌皮神經(jīng)低(P＜0.05)。
　　結(jié)論: 尺、肌皮神經(jīng)纖維代償性放大模型建立后，縫合口遠(yuǎn)端的尺神經(jīng)早期較低的BDNF mRNA、中晚期較低的NGF mRNA表達(dá)量是引起尺神