同型半胱氨酸致泡沫細(xì)胞形成中miR-148a-152與DNMT1的相互作用研究.pdf

1、目的：
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病發(fā)生的重要基礎(chǔ)性病變，其發(fā)病率高，危害性大，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，被認(rèn)為是人類健康的第一殺手。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明高同型半胱氨酸(Hcy)血癥是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要調(diào)控方式在Hcy致AS形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可以影響整體基因組和單個(gè)基因(如FABP4、Cyclin A、ABCA1、ACAT1等)啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化變

2、化進(jìn)而影響基因表達(dá)水平，參與動(dòng)脈粥樣斑塊核心成分--泡沫細(xì)胞的形成。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)作為維持性的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，在基因DNA甲基化過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)控作用，具有重要的生物學(xué)活性。MicroRNA(miRNA)是近些年研究比較熱的小分子非編碼RNA，它可以與靶基因mRNA的3’UTR結(jié)合影響基因表達(dá)改變，研究表明同一個(gè)miRNA可同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因，且同一個(gè)靶基因也可同時(shí)受多個(gè)miRNA調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn)DNMT1和miRN

3、A均參與Hcy致AS過(guò)程中。因此本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)能夠調(diào)控DNMT1的特異性miRNA并驗(yàn)證，探討二者在Hcy致泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中的作用，闡明特異性miRNA與其靶基因DNMT1的相互調(diào)控的具體機(jī)制。
　　方法：
　　(1)通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)能夠調(diào)控DNMT1的特異性miRNA；培養(yǎng)THP-1單核源性泡沫細(xì)胞，油紅O染色鑒定；運(yùn)用qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)不同濃度Hcy(0、50、100、200、50

4、0μmol·L-1)及100/mol·L-1Hcy+葉酸+維生素B12(H+F+V)干預(yù)泡沫細(xì)胞后，miR-148a/152和DNMT1的表達(dá)改變，明確其是否參與Hcy致泡沫細(xì)胞的形成過(guò)程。
　　(2)使用慢病毒包裝的miR-148a/152mimic和inhibitor感染泡沫細(xì)胞，分別過(guò)表達(dá)或抑制miR-148a/152，檢測(cè)其對(duì)DNMT1mRNA和蛋白表達(dá)的影響；同時(shí)，針對(duì)miR-148a/152與DNMT1特異性結(jié)合的堿基

5、位點(diǎn)，構(gòu)建野生型(Wt)和突變型(Mut)的3’UTR螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒，分別與miR-148a/152mimic和inhibitor共轉(zhuǎn)染，運(yùn)用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)靶基因DNMT1螢光素酶活性改變，明確DNMT1是miR-148a/152的靶基因并確定兩者結(jié)合的特異性序列。采用膽固醇檢測(cè)試劑盒分析miR-148a/152過(guò)表達(dá)或抑制后對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量變化的影響，確定miR-148a/152在Hcy致泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中的作用。

6、
　　(3)選擇對(duì)泡沫細(xì)胞作用顯著的100mol·L-1Hcy干預(yù)泡沫細(xì)胞，通過(guò)甲基化特異性PCR(nMS-PCR)檢測(cè)miR-148a/152啟動(dòng)子區(qū)甲基化改變，同時(shí)構(gòu)建DNMT1腺病毒重組質(zhì)粒并感染泡沫細(xì)胞，檢測(cè)DNMT1過(guò)表達(dá)后miR-148a/152啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化變化，確定Hcy對(duì)泡沫細(xì)胞miR-148a/152啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的影響并分析DNMT1在miR-148a/152啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化過(guò)程中的調(diào)控作用。

7、
　　結(jié)果：
　　(1)通過(guò)生物信息學(xué)分析提示調(diào)控DNMT1的特異性miRNA為miR-148a/152；不同濃度Hcy干預(yù)泡沫細(xì)胞后，DNMT1表達(dá)降低，miR-148a/152表達(dá)升高，以100μmol·L-1Hcy組改變最明顯，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)，給予100μmol·L-1Hcy+葉酸+維生素B12后上述情況改善(P<0.05)。
　　(2)過(guò)表達(dá)miR-148a/152后DNMT1mRN

8、A和蛋白水平明顯下降，而抑制miR-148a/152后DNMT1mRNA和蛋白水平明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。將野生型DNMT13’UTR螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒與miR-148a/152的mimic共轉(zhuǎn)染，螢光素酶活性明顯下降，差異有顯著性(P<0.05)，而與inhibitor共轉(zhuǎn)染后結(jié)果相反；將突變型DNMT13’UTR螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒與miR-148a/152mimic和inhibitor共轉(zhuǎn)染，螢光素酶活性無(wú)明顯改變。提示

9、miR-148a/152可能通過(guò)與DNMT1的mRNA3’UTR堿基UGCACUG發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而靶向抑制其表達(dá)水平。過(guò)表達(dá)miR-148a/152后，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和游離膽固醇明顯增加(P<0.05)，沉默miR-148a/152后，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和游離膽固醇明顯降低(P<0.05)，而細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯變化不明顯。
　　(3)給予100μmol·L-1Hcy干預(yù)泡沫細(xì)胞后，miR-148a/152甲基化呈下降趨勢(shì)，差異有顯著

10、性(P<0.05)，同時(shí)給予葉酸+維生素B12干預(yù)后，miR-148a/152甲基化水平較100μmol·L-1Hcy升高；使用腺病毒過(guò)表達(dá)DNMT1后，miR-148a/152啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平均升高(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)miR-148a/152是DNMT1的特異性miRNA，其可能通過(guò)增加泡沫細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和游離膽固醇含量與DNMT1一并參與了Hcy致泡沫細(xì)胞形成過(guò)程。
　　(2)miR-