抑制性受體ILTs及其配體的胃癌表達(dá)的實驗和臨床研究.pdf

1、研究背景：胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病，全球每年有超過93萬新發(fā)的胃癌病例，胃癌死亡率約為29.34/10萬(男性40.80/10萬，女性18.60/10萬)，是世界范圍高居第二位的癌癥死亡原因。據(jù)衛(wèi)生部疾控司2006年統(tǒng)計，我國每年新發(fā)胃癌患者約40萬人，因胃癌死亡患者約30萬人，患病率和死亡率超過世界平均水平的兩倍。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對胃癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)和臨床研究，取得了部分成果。但在胃癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、干預(yù)

2、治療和預(yù)后判斷方面，仍處于積極的探索階段。因此深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，探討胃癌發(fā)病過程中腫瘤和免疫細(xì)胞的功能及狀態(tài)，對研究胃癌及干預(yù)治療無疑具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 胃癌的病因目前仍不十分清晰。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)病與飲食因素、感染因素、遺傳因素及其他環(huán)境因素有關(guān)。近年最新的研究認(rèn)為，胃癌的發(fā)生發(fā)展是宿主免疫系統(tǒng)和胃癌細(xì)胞相互作用的結(jié)果，不僅涉及到宿主效應(yīng)細(xì)胞多種功能(T淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能異常、活化障礙及凋亡增加)及細(xì)胞

3、因子(IFN-γ含量降低、IL-10含量升高等)的改變，還與胃癌細(xì)胞自身的異常(缺乏協(xié)同刺激分子、MHC表達(dá)降低或缺失、FasL高表達(dá))及相關(guān)癌基因及抑癌基因異常密切相關(guān)。其中腫瘤細(xì)胞表面缺少共刺激分子的表達(dá)是免疫逃逸的主要原因。目前發(fā)現(xiàn)共刺激分子有兩種，即正性共刺激分子和負(fù)性共刺激分子。正性共刺激分子通過與淋巴細(xì)胞的受體結(jié)合共刺激免疫反應(yīng)，影響T細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞因子分泌。而負(fù)性共刺激分子通過兩種方法來誘導(dǎo)T細(xì)胞無能：一是誘導(dǎo)抑制

4、因子表達(dá)在效應(yīng)性免疫細(xì)胞上，二是誘導(dǎo)抑制性因子受體表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上。
　　 免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子(Ig-like transcripts，ILTs)或白細(xì)胞抑制受體是最近發(fā)現(xiàn)的一類HLA-I受體家族，目前發(fā)現(xiàn)有九個家族成員，在T淋巴細(xì)胞、單個核細(xì)胞、NK細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞表面廣泛表達(dá)。不同種類的ILTs通過傳導(dǎo)抑制性或刺激性信號發(fā)揮廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，在抑制免疫殺傷細(xì)胞的殺傷活性、調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞間的信號傳遞、參與樹突狀細(xì)胞的

5、抗原俘獲等方面具有重要的生物學(xué)意義。其中ILT2、ILT3、ILT4屬抑制性受體，其結(jié)構(gòu)共同特點是有一個長的膜內(nèi)段，含有3個免疫受體酪氨酸抑制基序，有4個或2個膜外的IgSF區(qū)。該類因子的功能主要是抑制分子，但其在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)和功能尚不清楚。
　　 HLA-G分子是一種非經(jīng)典HLA-I類抗原，該基因具有8個外顯子和7個內(nèi)含子。HLA-G分子在結(jié)構(gòu)上胞內(nèi)段很短，并且原始的HIA-G轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)選擇性剪切產(chǎn)生7種mRNA，編碼出7

6、種HLA-G蛋白異構(gòu)體。其中HLA-G1和HLA-G5可以高特異性結(jié)合ILT2、ILT4，且與ILT2、ILT4結(jié)合親和力比經(jīng)典HLA-I與ILT2、ILT4親和大3-4倍。HLA-G分子通過抑制免疫活性細(xì)胞的功能在免疫耐受的建立和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HLA-G可通過與NK細(xì)胞、T細(xì)胞、APC等細(xì)胞表面的抑制性受體ILT-2、ILT-4等結(jié)合發(fā)揮抑制性免疫調(diào)節(jié)作用。可溶性HLA-G(sHLA-G)還可與CD8+細(xì)胞受體結(jié)合，誘導(dǎo)NK細(xì)胞

7、和T細(xì)胞的凋亡、抑制同種特異性T細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。除此之外，研究顯示，HLA-G還可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和抑制性NK細(xì)胞的產(chǎn)生，并可在很大程度上通過移植細(xì)胞顆粒極化來保護(hù)靶細(xì)胞不被NK細(xì)胞和T細(xì)胞殺傷。HLA-G分子除表達(dá)于胎盤絨毛膜細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞外，還可少量表達(dá)在眾多組織細(xì)胞上，包括T淋巴細(xì)胞。而胃癌患者中淋巴細(xì)胞HLA-G表達(dá)變化如何?作為抑制性受體ILT2、ILT4等的主要配體，在不同分化程度胃癌發(fā)生過程中所起作用如何，目前尚不清晰

8、。
　　 研究目的和方法：
　　 一、本研究采用實時熒光定量PCR-Sybr Green I和FACS流式細(xì)胞術(shù)等方法對人的高分化胃癌細(xì)胞株(MKN1)、中分化胃癌細(xì)胞株(SGC-7901、AGS)、低分化胃癌細(xì)胞株(MGC803)和未分化分化胃癌細(xì)胞株(HGC-27、BCG823)中的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測和分析，系統(tǒng)地探討了ILT2、ILT3和ILT4在不同分化程度的人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)變化，為后期試驗和相關(guān)研究

9、提供了試驗依據(jù)。
　　 二、為了探討不同表達(dá)程度的抑制性受體ILTs對免疫細(xì)胞的影響，我們通過體外細(xì)胞試驗，將ILT2lowILT3lowILT4low胃癌細(xì)胞MKN1和ILT2highILT3highILT4high胃癌細(xì)胞HGC-27分別與PBMC和NK細(xì)胞共培養(yǎng)，通過檢測細(xì)胞殺傷活性(MTT)，CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上HLA-G分子的表達(dá)改變探討抑制性受體ILTs對效應(yīng)細(xì)胞的調(diào)控作用。
　　 三、為

10、進(jìn)一步探討抑制性受體ILT2、ILT3和ILT4在臨床應(yīng)用中的價值，采用免疫組織化學(xué)方法檢測了臨床不同分化程度胃癌患者病理組織中ILT2、ILT3和ILT4的表達(dá)，并探討了其與腫瘤生物學(xué)行為和臨床特征的關(guān)系。
　　 四、為了探討作為抑制性受體ILTs主要配體的HLA-G在臨床胃癌患者淋巴細(xì)胞中的表達(dá)變化，應(yīng)用TaqMan探針FQ-PCR和FACS流式細(xì)胞術(shù)對不同分化胃癌患者外周血淋巴細(xì)胞HLA-G mRNA和CD4+、CD8+T

11、淋巴細(xì)胞上HLA-G分子表達(dá)及其與臨床進(jìn)程的關(guān)系進(jìn)行了初步分析。
　　 以上研究通過體外細(xì)胞試驗和臨床應(yīng)用研究，系統(tǒng)的探討了抑制性受體ILT2、ILT3和ILT4在不同分化程度的胃癌細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對效應(yīng)細(xì)胞的影響，期望為闡明胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供實驗依據(jù)，同時為臨床胃癌的診斷、防治和新藥開發(fā)尋找新的靶目標(biāo)提供依據(jù)。
　　 結(jié)果及結(jié)論：
　　 一、胃癌細(xì)胞株抑制性受體ILTs mRNA和蛋白表達(dá)

12、　　 1.實時熒光定量PCR-Sybr Green I檢測結(jié)果表明，6株不同分化程度的人胃癌細(xì)胞均不同程度表達(dá)了ILT2、ILT3和ILT4 mRNA，尤以ILT2表達(dá)最強(qiáng)。其中在高分化的胃癌細(xì)胞株MKN1中ILT2、ILT3和ILT4 mRNA表達(dá)最低，未分化胃癌細(xì)胞株HGC-27和BCG823的mRNA表達(dá)最高，顯示隨分化程度存在顯著性差異。
　　 2.FACS流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，6株胃癌細(xì)胞中除一株未分化胃癌細(xì)胞BCG8

13、23表達(dá)ILT3、ILT4極低外，其余均檢測到ILT2、ILT3和ILT4不同程度的蛋白表達(dá)，且其表達(dá)程度與腫瘤細(xì)胞分化相關(guān)，尤以ILT2表現(xiàn)最明顯。
　　 上述實驗結(jié)果表明，通過某種共同信號途徑使惡性程度高的胃癌細(xì)胞高表達(dá)抑制性受體ILT2、ILT3和ILT4，并可能影響到效應(yīng)細(xì)胞的功能及對腫瘤的殺傷。
　　 二、抑制性受體ILTs對效應(yīng)細(xì)胞調(diào)控的實驗研究
　　 1.ILT2highILT3highILT4hi

14、gh胃癌細(xì)胞HGC-27與PBMC、NK細(xì)胞共培養(yǎng)后效應(yīng)細(xì)胞殺傷活性(MTT)較ILT2lowILT3lowILT4low胃癌細(xì)胞MKN1與PBMC、NK細(xì)胞共培養(yǎng)后效應(yīng)細(xì)胞殺傷活性顯著降低，初步表明胃癌細(xì)胞不同表達(dá)程度的ILT2、ILT3、ILT4影響PBMC、NK細(xì)胞的增殖和殺傷作用。
　　 2.ILT2highILT3highILT4high的HGC-27細(xì)胞和ILT2lowILT3lowILT4low的MKN1細(xì)胞分別與

15、PBMC和NK細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，與各自對照相比，T細(xì)胞和NK細(xì)胞表面HLA-G的表達(dá)明顯變化，且ILT2highILT3highILT4high的HGC-27細(xì)胞對HLA-G的影響較ILT2lowILT3lowILT4low的MKN1細(xì)胞更明顯。其中T淋巴細(xì)胞HLA-G主要表達(dá)于CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞表達(dá)很低或基本不表達(dá)；CD56+NK細(xì)胞表達(dá)結(jié)果顯示同樣的趨勢，但總體表達(dá)水平較CD4+細(xì)胞低。
　　 實驗結(jié)果提示胃癌

16、細(xì)胞上ILT2、ILT3和ILT4分子表達(dá)對效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性有影響，并可能對HLA-G的表達(dá)有一定的調(diào)控作用。
　　 三、胃癌患者ILT表達(dá)的臨床應(yīng)用研究
　　 免疫組織化學(xué)分析顯示，50例不同組織類型、不同分化程度的胃癌患者病理組織中ILT2、ILT3和ILT4分子有不同程度的表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)形式是散在的，可位于胃癌細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)或兩者皆有，病灶周圍的基質(zhì)細(xì)胞也有部分表達(dá)。ILT2、ILT3和ILT4表達(dá)陽性

17、率在50例胃癌組織標(biāo)本中差異較大。其中ILT2表達(dá)陽性率最高，為62.0％(31/50)，ILT3、ILT4表達(dá)陽性率分別為18.096(9/50)和34％(17/50)，正常胃組織中未見ITL2，ILT3，ILT4的表達(dá)。提示抑制性受體ILTs，尤其是ILT2有可能成為胃癌臨床診斷的有價值指標(biāo)，并為胃癌臨床干預(yù)治療提供新的靶點。
　　 四、胃癌患者淋巴細(xì)胞非經(jīng)典HLA-G的表達(dá)
　　 1.通過TaqMan探針FQ-PC

18、R檢測發(fā)現(xiàn)，胃癌患者及健康對照淋巴細(xì)胞HLA-GmRNA總體表達(dá)水平較弱。其中，胃癌臨床分級Ⅰ+Ⅱ期的患者與健康對照相比相對表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)；臨床分級Ⅲ+Ⅳ期患者轉(zhuǎn)錄水平較Ⅰ+Ⅱ期相對表達(dá)量低(P<0.05)。而從臨床病理組織分化程度分析，分化良好型與低分化型胃癌患者HLA-G mRNA表達(dá)未見明顯改變。
　　 2.通過FACS流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，無論健康對照和胃癌患者，淋巴細(xì)胞HLA-G分子表達(dá)陽性率均較低。