siRNA干擾VEGF-C表達(dá)抑制胃癌淋巴生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在體外，應(yīng)用RNA干擾(RNAi)的方法抑制胃腺癌細(xì)胞株SGC7901淋巴內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)的表達(dá)，探討其抑制SGC7901細(xì)胞VEGF-C表達(dá)的有效性，并篩選有效的小干擾RNA(siRNA)；建立BALB/c裸鼠SGC7901皮下移植瘤模型，在體內(nèi)，研究瘤內(nèi)注射siRNA抑制VEGF-C表達(dá)能否導(dǎo)致胃癌生長受抑和胃癌淋巴管生成受抑。 方法：體外實(shí)驗(yàn)：設(shè)計(jì)并化學(xué)合成siRNA，并通過非變性凝膠電泳(PAGE)

2、純化；脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞株SGC7901，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并四氮唑鹽比色法(MTT)檢測細(xì)胞增殖；熒光素6-Fam標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察并計(jì)算siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞的效率；半定量RT-PCR檢測不同siRNA實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞VEGF-C mRNA水平變化；半定量RT-PCR和Western blot法檢測經(jīng)VEGF-C小干擾RNA(VEGF-CsiRNA)干預(yù)后SGC7901細(xì)胞隨

3、時(shí)間變化mRNA和蛋白水平的變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：裸鼠皮下注射SGC7901細(xì)胞構(gòu)建胃癌皮下移植瘤模型24只，隨機(jī)分為4組為：siRNA脂質(zhì)體混合液注射組、單脂質(zhì)體注射組、單siRNA注射組和PBS注射組，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)0.5cm，即進(jìn)行VEGF-CsiRNA瘤內(nèi)注射，每隔6天注射一次，共注射3次，隨后記錄各實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積變化，免疫組織化學(xué)法檢測各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織VEGF--C的表達(dá)，并通過抗人CD31和LYVE-1單克隆抗體檢測瘤體內(nèi)血管和淋巴

4、管生成情況。 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)：脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA體外轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞，VEGF-CsiRNA轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)細(xì)胞生長減慢，但MTT結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染組、單用脂質(zhì)體組和轉(zhuǎn)染VEGF-CsiRNA干擾組細(xì)胞凋亡情況無明顯差異(P>0.05)；6-Fam標(biāo)記的siRNA和GAPDHsiRNA分別轉(zhuǎn)染SGC7901，顯示siRNA在工作濃度為100mmol/L轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)化，其轉(zhuǎn)染效率為37.1％±3.0％，內(nèi)源性基因GAPDHmRNA下

5、調(diào)為未轉(zhuǎn)染組的的65.5％±3-3％；半定量RT-PCR篩選結(jié)果顯示No.1VEGF-CsiRNA為有效的敲減VEGF-C表達(dá)的小干擾RNA，使VEGF-CmRNA下調(diào)為對(duì)照組的52.5％±2.6％，且在轉(zhuǎn)染后48h左右出現(xiàn)VEGFmRNA的敲減高峰，VEGF-CmRNA水平下調(diào)為對(duì)照組的43.5％；Western blot檢測顯示VEGF-C蛋白的表達(dá)下調(diào)為對(duì)照組的32.7％±1.1％，且在轉(zhuǎn)染72h后出現(xiàn)VEGF-C蛋白的敲減高峰，

6、蛋白水平下調(diào)為對(duì)照組的18.9％。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：VEGF-CsiRNA干擾組較對(duì)照組腫瘤生長明顯減慢(P<0.001)，siRNA加用脂質(zhì)體干擾組和單用siRNA干擾組腫瘤生長無明顯差別(P>0.05)。免疫組化抗人VEGF-C單抗檢測干擾組腫瘤細(xì)胞VEGF--C染色減弱，和對(duì)照組相比VEGF--C表達(dá)下調(diào)68.3％(P<0.01)，同時(shí)抗人LYVE-1單抗免疫組化染色表明胃癌組織中淋巴生成減少，干擾組LND值為3.2±1.3，而對(duì)照組為9

7、.8±2.7，VEGF-CsiRNA干擾組IND值下降至對(duì)照組的32.7％(P<0.01)，而干擾組和對(duì)照組的MVD值無明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)篩選的siRNA能有效抑制胃癌細(xì)胞的VEGF-C基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)，在體外干擾VEGF-C的表達(dá)，能使細(xì)胞出現(xiàn)生長減慢但不能使細(xì)胞發(fā)生凋亡。在胃癌動(dòng)物模型中，瘤內(nèi)注射VEGF-CsiRNA能顯著下調(diào)腫瘤組織內(nèi)VEGF-C的表達(dá)，抑制胃癌皮下瘤生長，同時(shí)抑制瘤內(nèi)淋