降鈣素基因相關(guān)肽抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌重構(gòu)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 心肌重構(gòu)是指心肌在多種病理情況下(如缺血、壓力超負(fù)荷等)作出的適應(yīng)性反應(yīng),包括心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡等。早期的重構(gòu)在短期內(nèi)對(duì)維持心功能具有一定的積極作用,但持續(xù)的重構(gòu)會(huì)導(dǎo)致心功能失代償而出現(xiàn)心力衰竭。最近的研究表明,辣椒素敏感的感覺神經(jīng)功能低下以及microRNA-1、microRNA-133a和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)異?？赡軈⑴c了心肌重構(gòu)的形成。敲除辣椒素受體(VR1)可加重心肌缺血誘

2、導(dǎo)的心肌重構(gòu),激活VR1促進(jìn)感覺神經(jīng)遞質(zhì)的釋放則具有改善心功能的作用,說明病理狀態(tài)下的心肌重構(gòu)可能與感覺神經(jīng)功能低下有關(guān)。吳茱萸次堿(Rut)是從中藥吳茱萸中提取的一種生物堿,可通過激活VR1促進(jìn)感覺神經(jīng)遞質(zhì)——降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的合成和釋放發(fā)揮一系列的心血管保護(hù)作用。基于心肌重構(gòu)可能與感覺神經(jīng)功能低下有關(guān),因此本實(shí)驗(yàn)以異丙腎上腺素(Iso)誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)為模型,探討降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)在心肌重構(gòu)中的作用和機(jī)制;并探討

3、吳茱萸次堿(Rut)對(duì)心肌重構(gòu)的作用和機(jī)制。
　　 方法：
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
　　 SD大鼠每天皮下給予Iso(5mg/kg,連續(xù)10天)誘導(dǎo)心肌重構(gòu)模型,Rut治療組在皮下注射Iso的同時(shí),灌胃給予不同劑量的Rut(10mg/kg或40mg/kg)。給藥結(jié)束后,檢測(cè)大鼠心臟結(jié)構(gòu)的變化(超聲心動(dòng)圖);分離心臟,測(cè)量全心重與體重以及左心室重與體重的比值;觀察心肌細(xì)胞大小的改變(蘇木素.伊紅染色)以及肥大標(biāo)志物心鈉素

4、(ANP)和腦鈉素(BNP)mRNA表達(dá)(RT-PCR)的變化;檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(TUNEL染色)以及凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2mRNA的表達(dá)(RT-PCR);觀察心肌膠原沉積(Masson染色)以及Ⅰ、Ⅲ型膠原和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)mRNA表達(dá)(RT-PCR)的變化;檢測(cè)心肌組織microRNA-1和microRNA-133a的表達(dá)(real-time PCR);取血漿和背根神經(jīng)節(jié)分別檢測(cè)CGRP的血漿濃度(放射免疫法

5、)和α、β-CGRPmRNA的表達(dá)(RT-PCR)。
　　 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：
　　 體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞,以Iso來誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡和成纖維細(xì)胞的增殖,CGRP在Iso處理前1h給予。藥物處理結(jié)束后,觀察細(xì)胞活力的變化(MTT)以及心肌細(xì)胞凋亡的改變(Hoechest染色和流式細(xì)胞術(shù));檢測(cè)心肌細(xì)胞Bax和Bcl-2以及成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)mRNA的表達(dá)(RT-PCR);觀察心肌

6、細(xì)胞microRNA-1和microRNA-133a表達(dá)的變化(real-time PCR)以及細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的改變(DCFH-DA熒光法)。
　　 結(jié)果：
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
　　 與對(duì)照組相比,給予Iso后可明顯增加大鼠的收縮末左室內(nèi)徑(LEVDs)、收縮末左室后壁厚度(LVPWTs)和舒張末左室后壁厚度(INPWTd)以及全心重與體重、左心室重與體重的比值,同時(shí)心肌細(xì)胞橫截面積和ANP、BNP m

7、RNA的表達(dá)也顯著增加;心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bax mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高,而Bcl-2的mRNA表達(dá)則顯著降低;給予Iso后大鼠心肌組織中膠原的沉積以及Ⅰ、Ⅲ型膠原和CTGF mRNA的表達(dá)顯著增加;Iso還可明顯上調(diào)microRNA-1的表達(dá),而microRNA-133a的表達(dá)則顯著下調(diào);Iso處理大鼠后可顯著降低背根神經(jīng)節(jié)α、β-CGRP mRNA的表達(dá)和血漿中CGRP的濃度。給予Rut可顯著促進(jìn)CGRP的合成和釋放,同時(shí)心

8、肌重構(gòu)得到明顯的改善,而預(yù)先應(yīng)用CGRP耗竭劑——辣椒素耗竭CGRP后則可取消Rut的上述有益作用。
　　 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：
　　 在心肌細(xì)胞,Iso處理后可顯著降低細(xì)胞的活性,增加心肌細(xì)胞的凋亡;促凋亡基因Bax mRNA的表達(dá)在Iso處理后明顯上調(diào),而抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)并無顯著性改變,導(dǎo)致Bax與Bcl-2的比值明顯增加;Iso可明顯上調(diào)心肌細(xì)胞microRNA-1的表達(dá)以及下調(diào)microRNA-133a

9、的表達(dá);另外,Iso處理后還可顯著升高細(xì)胞內(nèi)ROS的水平;預(yù)先給予CGRP后,可明顯降低ROS的產(chǎn)生以及抑制Iso誘導(dǎo)的microRNA-1和microRNA-133a表達(dá)的變化,同時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡也顯著降低,但CGRP的這種保護(hù)作用可被CGRP受體拮抗劑CGRP8-37所取消。在心肌成纖維細(xì)胞,Iso處理后可明顯增加細(xì)胞的增殖活性;Ⅰ、Ⅲ型膠原和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)mRNA的表達(dá)也顯著增加;細(xì)胞內(nèi)ROS的水平在Iso處理后也明

10、顯高于對(duì)照組;預(yù)先應(yīng)用CGRP后也可顯著抑制Iso的上述效應(yīng),同樣,CGRP的這種保護(hù)作用可被CGRPs-37所取消。
　　 結(jié)論1.辣椒素敏感感覺神經(jīng)的功能減弱以及miRNA-1、miRNA-133a和CTGF的表達(dá)異?？赡軈⑴c了Iso誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)的形成;2.Rut可抑制Iso誘導(dǎo)的心肌重構(gòu),其機(jī)制與激活VR1促進(jìn)CGRP的合成和釋放,進(jìn)而調(diào)節(jié)miRNA-1、miRNA-133a和CTGF的表達(dá)有關(guān);3.CGRP對(duì)miRNA