胸腺γδT細(xì)胞的分化去向.pdf

1、多能淋巴干細(xì)胞遷移至胸腺，從胸腺的皮質(zhì)逐漸移行到髓質(zhì)，經(jīng)過陽性選擇和陰性選擇，逐步分化成熟為T細(xì)胞。T細(xì)胞表面的抗原受體(T cell receptor) TCR有兩類，一類是由α鏈和β鏈組成的TCRαβ，另一類是由γ鏈和δ鏈組成的TCRγδ。迄今為止，關(guān)于TCRγδ細(xì)胞分化成熟的過程以及生理功能、識別抗原的特點(diǎn)等方面還所知不多，遠(yuǎn)沒有TCRαβ細(xì)胞那樣詳盡。γδT細(xì)胞主要分布于皮膚和粘膜組織，數(shù)量較少，但它在抵御外界病原體侵害、免疫調(diào)

2、節(jié)和腫瘤免疫等諸多方面都有著不可替代的作用。因此，γδT細(xì)胞也引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。近幾年的研究表明：γδT細(xì)胞以胸腺內(nèi)和胸腺外兩條途徑發(fā)育。胸腺內(nèi)發(fā)育的依據(jù)是應(yīng)用骨髓干細(xì)胞在胸腺組織內(nèi)培養(yǎng)可以誘導(dǎo)分化為γδT細(xì)胞。Ciofani M等人在2007年的研究中發(fā)現(xiàn)大量的胸腺衍生信號和高度保守的分化途徑，促使T細(xì)胞逐步分化成熟。T細(xì)胞的發(fā)育是以級聯(lián)方式有序發(fā)生的，TCR基因的啟動(dòng)順序依次為TCR D(δ)-TCRG(γ)-TCRB(β)-T

3、CRA(α)，αβT細(xì)胞的分化不可能繞過TCRD(δ)-TCRG(γ)基因的表達(dá)而直接表達(dá)αβTCR。故推測αβT細(xì)胞來自于γδT細(xì)胞，γδT細(xì)胞應(yīng)處于固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的中間過渡階段。過渡性免疫應(yīng)答理論認(rèn)為部分胸腺γδT細(xì)胞可分化為αβT細(xì)胞。我們以胎齡14.5d C57BL/6胎鼠為研究對象，采用胚胎胸腺器官培養(yǎng)(FTOC)、CFSE染色及流式細(xì)胞分選和檢測等技術(shù)來觀察胸腺γδT細(xì)胞的分化去向，為過渡性免疫應(yīng)答提供科學(xué)的理

4、論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料: 一、主要試劑 APC—抗CD4；PE—抗CD8；Cy5—抗CD3；CFSE；羊抗鼠的一抗sc—1778 TCRγ：IgG和Texa Red—抗TCRγ二抗；羊抗鼠的一抗sc—9101 TCRβ： IgG和Texa Red—抗TCRβ二抗；DMSO；Mtb—Ag；IL—2；培養(yǎng)液Ⅰ：20％胎牛血清RPMI1640；培養(yǎng)液Ⅱ：20％成鼠血清RPMI1640(除血清不同外，兩種培養(yǎng)液其他成分相同

5、)等。 二、主要儀器 體視顯微鏡；流式細(xì)胞儀；熒光顯微鏡；顯微外科鑷、剪；CO2恒溫培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡；臺(tái)式離心機(jī)；小離心機(jī)；超凈空氣凈化臺(tái)；酶標(biāo)儀；超聲波細(xì)胞破碎儀80W等。 三、試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級14.5d C57BL/6孕鼠(雌雄比例為2：1，晚8點(diǎn)合籠過夜，第二天檢查出現(xiàn)陰道栓的為第0.5d)。C57BL/6小鼠(5—6周齡)購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京試驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號：SCXK(北京)200

6、4-0001。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、體外胚胎胸腺器官培養(yǎng)(FTOC)方法的建立 將無菌明膠海綿置于24孔板中，將經(jīng)消毒處理過的無菌0.8μm微孔濾膜(剪成直徑約1ml的圓形)置于凝膠海綿上。分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，第1組加1ml的培養(yǎng)液Ⅰ；第Ⅱ組加1ml的培養(yǎng)液Ⅱ。無菌取胎齡14.5d C57BL/6胎鼠胸腺，隨機(jī)分別放置在浸于不同培養(yǎng)液中的濾膜上，一個(gè)胎鼠的兩個(gè)胸腺小葉放入不同的實(shí)驗(yàn)組，每孔4個(gè)小葉。胚胎胸腺器官保持在氣液

7、界面中，置37℃，5％體積分?jǐn)?shù)CO2孵箱孵育，每隔3d更換培養(yǎng)液。隔天檢測胚胎胸腺細(xì)胞亞群隨體外培養(yǎng)時(shí)間延長的變化。 二、不同胎齡胎鼠體內(nèi)胸腺細(xì)胞表達(dá)γδTCR的時(shí)相 采用熒光抗體標(biāo)記、流式檢測技術(shù)，分別檢測12.5d、13.5d、14.5d、15.5d、16.5d各胎齡C57BL/6胎鼠體內(nèi)胸腺細(xì)胞表達(dá)γδTCR的時(shí)相。 三、刺激因素的濃度及其促進(jìn)增殖的時(shí)相 刺激因素包括Mtb—Ag和IL—2。制備C5

8、7BL/6小鼠胸腺單細(xì)胞懸液，接種到2塊96孔培養(yǎng)板中，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入5μg/ml、7μg/ml、9μg/ml三個(gè)不同濃度的刺激因素(Mtb—Ag)10μl，對照組加入等量的等滲0.1M的PBS。置37℃、5％體積分?jǐn)?shù)CO2孵箱孵育，繼續(xù)孵育。在第3、6d，采用MTT比色法觀察不同濃度的Mtb—Ag對C57BL/6小鼠胸腺細(xì)胞的增殖變化。以刺激因素的最佳濃度和14.5d胎齡C57BL/6小鼠胸腺單細(xì)胞懸液體外共培養(yǎng)，

9、分別于第0、2、4、6、8d標(biāo)記γ鏈熒光抗體，檢測胸腺γδT細(xì)胞的增殖時(shí)相。 四、純化胸腺γδT細(xì)胞與CFSE染色 制備14.5d胎齡C57BL/6小鼠胸腺單細(xì)胞懸液，體外應(yīng)用刺激因素培養(yǎng)2d后，標(biāo)記γ鏈熒光抗體，進(jìn)行流式分選純化，然后以CFSE最佳濃度染色。 五、胸腺γδT細(xì)胞的分化去向 排除γ鏈熒光抗體的干擾作用，將FCSE染色的胸腺γδT細(xì)胞加入胚胎胸腺器官的濾膜上進(jìn)行孵育，分別在第5、8d加入抗β

10、鏈的熒光抗體，流式檢測其分化去向。 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較采用單因素方差分析(one—way ANOVA)，用SPSS16.0軟件完成。P<0.05有顯著性差異。 結(jié)果: FTOC系統(tǒng)中使用培養(yǎng)液Ⅰ能更好的接近于體內(nèi)前體T細(xì)胞的發(fā)育過程：14.5d胎齡小鼠體內(nèi)胸腺細(xì)胞表達(dá)γδTCR為總胸腺細(xì)胞數(shù)的15.07％，和12.5d、13.5d、15.5d、16.5d胎齡小鼠體內(nèi)

11、胸腺細(xì)胞相比，所占比例最高；Mtb—Ag7μg/ml和5μg/ml、9μg/ml相比較對小鼠胸腺細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用(p<0.05)；加入適宜濃度的刺激因素，體外培養(yǎng)第2d胸腺γδT細(xì)胞增殖達(dá)到高峰：用于分選的胸腺細(xì)胞的濃度為1×107個(gè)/ml共1ml，分選的陽性細(xì)胞為3％；30μm的CFSE是最佳試驗(yàn)濃度；第5d由CFSE染色的胸腺γδT細(xì)胞分化為αβT細(xì)胞的分化率為8.12％，第8d為3.36％。 討論: 分子

12、遺傳學(xué)研究證明，在胚胎期多能淋巴干細(xì)胞進(jìn)入胸腺時(shí)，其受體基因還未發(fā)生重排，胚胎14.5d發(fā)現(xiàn)重排的TCRγ轉(zhuǎn)錄達(dá)高峰，TCRβ基因開始重排，TCRα基因重排晚于TCRβ基因2d。07年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TCRγ、δ主要在胚胎胸腺未成熟的T細(xì)胞膜上表達(dá)，而TCRα、β主要在成熟T細(xì)胞膜上表達(dá)。14.5d胎鼠胸腺T細(xì)胞基本處于原始、未成熟階段，取其進(jìn)行體外培養(yǎng)，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的推移，T細(xì)胞通過陽性和陰性選擇，不斷地分化為CD4+CD8+細(xì)胞，并進(jìn)

13、一步分化成熟為CD4+CD8—和CD4—D8+細(xì)胞，待體外胸腺培養(yǎng)8d后已有相當(dāng)數(shù)量的T細(xì)胞分化成熟為單陽性細(xì)胞。故14.5d胎齡鼠的胸腺細(xì)胞是進(jìn)行胸腺細(xì)胞發(fā)育研究的最佳起始時(shí)間。因此，本實(shí)驗(yàn)選用14.5d胎鼠胸腺器官采用FTOC技術(shù)進(jìn)行體外培養(yǎng)。在培養(yǎng)液的液相中我們發(fā)現(xiàn)大量的CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞輸出胸腺，其機(jī)制還不明確，但為我們輸入CFSE染色的胸腺γδT細(xì)胞提供了胸腺空間微環(huán)境，在此環(huán)境中，CFSE染色的胸腺γδT細(xì)胞在第5、

14、8d分化為αβT細(xì)胞的分化率分別為8.12％[812/(1×104個(gè)/ml×0.1ml)]和3.36％[336/(1×104個(gè)/ml×0.1ml)]。07年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)胚胎豬胸腺的CD4+γδT細(xì)胞代表過渡狀態(tài)和獨(dú)立亞型，不輸出胸腺；胸腺CD4+γδT細(xì)胞能在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下分化為TCRαβ細(xì)胞，這也為過渡性免疫應(yīng)答提供了科學(xué)的理論依據(jù)。 結(jié)論: 經(jīng)純化與CFSE染色的14.5d胎鼠胸腺γδT細(xì)胞在體外胚胎胸腺器官中孵