TK-MCP-1融合基因?qū)γ庖咧亟⊿CID小鼠腹腔卵巢癌治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 免疫重建SCID小鼠腹腔卵巢癌模型的建立及評價 目的：建立免疫重建SCID小鼠的荷人卵巢癌腹腔移植瘤模型，為卵巢癌生物學(xué)行為的觀察和生物學(xué)治療手段的探索提供可靠的研究載體。 方法：常規(guī)培養(yǎng)SKOV3腫瘤細(xì)胞，分別用高滴度產(chǎn)毒細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清(分別含pLXSN、pLXSN/TK、pLXSN/MCP-1或pLXSN/TK-MCP-1的病毒顆粒)感染SKOV3腫瘤細(xì)胞并用G418篩選。收獲各組細(xì)胞，提取總

2、RNA，以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測細(xì)胞中HSV-TK和(或)MCP-1基因表達(dá)情況。用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)測定C.B17/SCID小鼠血清中鼠IgG含量，檢驗(yàn)是否存在免疫滲漏。Ficoll密度法分離人體外周血單個核細(xì)胞，以腹腔注射方式行免疫重建及瘤細(xì)胞接種，根據(jù)接種瘤細(xì)胞的不同將人化SCID小鼠分為TK-MCP-1組、MCP-1組、TK組，并以接種SKOV3/neo細(xì)胞株的人化SCID小鼠作為對照組。ELISA法

3、檢測SCID小鼠血清中人IgG抗體水平，驗(yàn)證免疫重建。SCID小鼠種瘤后，觀察荷瘤鼠成瘤情況、生物學(xué)特性及組織學(xué)特性。 結(jié)果：以高滴度的病毒上清感染SKOV3細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后建立穩(wěn)定感染細(xì)胞SKOV3/neo、SKOV3/HSV-TK、SKOV3/MCP-1和SKOV3/TK-MCP-1；SKOV3/HSV-TK、SKOV3/MCP-1和SKOV3/TK-MCP-1細(xì)胞株中HSV-TK和(或)MCP-1基因穩(wěn)定表達(dá)。SCI

4、D小鼠腹腔注射人外周血單個核細(xì)胞3周后免疫重建成功。接種人SKOV3卵巢癌細(xì)胞2周后，SCID小鼠腹腔均有腫瘤生長。組織學(xué)顯示該模型腫瘤組織均保持人卵巢漿液性乳頭狀腺癌的特點(diǎn)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的免疫重建SCID小鼠荷人卵巢癌腹腔移植瘤模型能較好的模擬一定免疫功能下人卵巢癌腹腔播散的生物學(xué)行為，是研究卵巢癌生物治療較理想的動物模型。 第二部分 TK-MCP-1融合基因?qū)β殉舶w內(nèi)治療作用的研究 目的：探討

5、TK-MCP-1融合基因?qū)扇寺殉舶└骨灰浦擦龅拿庖咧亟⊿CID小鼠的體內(nèi)治療效果。 方法：各組SCID小鼠種瘤成功后，連續(xù)5天內(nèi)每天腹腔注射丙氧鳥苷(ganciclovir，GCV)75mg/kg，隨后每天觀察記錄小鼠的精神狀況、飲食和腹部膨隆情況。每組隨機(jī)抽取4只小鼠自種瘤成功后觀察至自然死亡，記錄其存活時間的長短。每組剩余的6只，待未治療組中小鼠出現(xiàn)死亡時將其全部處死，剖腹觀察腹腔內(nèi)腫瘤生長和擴(kuò)散情況。流式細(xì)胞儀檢測腫瘤組

6、織中巨噬細(xì)胞的百分含量。通過RT-PCR檢測腫瘤組織中TNF-αmRNA的表達(dá)量來表示巨噬細(xì)胞對腫瘤組織殺傷效應(yīng)。 結(jié)果：注射GCV前后，TK-MCP-1組腹部膨隆減小程度最大，精神狀況、飲食明顯改善，TK組和MCP-1組次之，對照組無明顯改變。SCID小鼠自種瘤成功后至自然死亡的平均存活時間，TK-MCP-1組最長，TK組和MCP-1組較長，對照組最短。治療后，TK-MCP-1組腹腔內(nèi)移植瘤播散明顯減少。TK組和MCP-1組腹

7、腔內(nèi)移植瘤播散也有減少，但不如TK-MCP-1組明顯，且TK組和MCP-1組相比無明顯差別。而對照組仍見腫瘤腹腔、盆腔廣泛播散。流式細(xì)胞儀檢測的各組小鼠腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的含量，TK-MCP-1組明顯高于MCP-1組、TK組及對照組，且各組間差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而MCP-1組與TK組比較無顯著性差異(P＞0.05)，但均明顯高于對照組(P＜0.05)。通過RT-PCR檢測TNF-αmRNA在腫瘤組織中的表達(dá)量，TK-

8、MCP-1組明顯高于MCP-1組、TK組及對照組，且各組間差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而MCP-1組與TK組相比無顯著性差異(P＞0.05)，但均明顯高于對照組(P＜0.05)。這說明TK-MCP-1組巨噬細(xì)胞對腫瘤組織殺傷效應(yīng)明顯高于其他3組，而MCP-1組與TK組又高于對照組。 結(jié)論：TK-MCP-1融合基因?qū)β殉舶┑捏w內(nèi)治療效果明顯優(yōu)于TK，MCP-1單基因治療，具有良好的應(yīng)用前景。 研究意義：近年來，