HER2與乳腺癌臨床-病理關系的前瞻性分析及其miRNAs調控研究.pdf

1、背景和目的： 原癌基因和抑癌基因是在細胞，生長過程中扮演者重要角色的兩大類基因。而原癌基因HER2的擴增是與乳腺癌相關的基因表達中最常見的改變。HER2基因位于17號染色體，編碼一種跨膜的具有酪氨酸激酶活性的生長因子受體。在乳腺浸潤性導管癌中HER2基因擴增或蛋白過表達的發(fā)生率約為20％～30％。有研究表明HER2基因擴增或蛋白過表達不僅是重要的與乳腺癌不良預后相關生物學標記，而且是對乳腺癌化療及內分泌治療反應具有指導作用的生物

2、學標記，雖然關于HER2能否作為確實可行的預后指標尚有不同的觀點，然而對HER2表達狀態(tài)的檢測已成為最佳化乳腺癌治療方案的重要步驟。免疫組化(IHC)和熒光原位雜交(FISH)已成為檢測HER2表達狀態(tài)的兩種最常用的方法。而且均被國內和國際的治療指南所推崇但究竟誰是檢測HER2表達狀態(tài)最佳的方法？是IHC的蛋白檢測法？還是FISH的基因檢測法？ 因此，本課題的目的之一是在當地的人群中前瞻性的研究乳腺癌患者關于HER2狀態(tài)檢測的F

3、ISH和IHC兩種方法的相關性以及乳腺癌HER2基因表達與乳腺癌臨床預后因素、激素受體表達的關系。為關于HER2基因在乳癌患者中表達比例的流行病學資料提供一些數據，為臨床推廣建立FISH檢測奠定一定的基礎。 在浸潤性乳腺癌病例中常常伴隨著17號染色體拷貝數的異常改變，其拷貝數可通過常規(guī)的遺傳學方法和FISH檢測來判斷。而這種改變常常影響到HER2基因的擴增和蛋白的表達。Watters和他的同事發(fā)現17號染色體拷貝數的異常改變與組

4、織分級III和ER陰性的的病例相關，但對生存期無明顯影響；另有研究提示17號染色體拷貝數的異常改變與乳腺癌不良預后因素相關。 因此，本課題的目的之二是當地的人群中研究乳腺癌患者17號染色體非整體性的發(fā)生率；分析17號染色體倍體性與HER2基因表達及HER2蛋白表達的相關性。以及17號染色體拷貝數與乳腺癌臨床預后因素、激素受體表達的關系。為探討17號染色體倍體性這一遺傳特征與乳腺癌生物學行為及預后的關系提供依據，進而為綜合評估乳腺

5、癌預后提供參考指標。 MicroRNA簡稱miRNAs是生物體內固有的單鏈、非蛋白編碼的長約22 nt的小分子RNA，它們主要通過與靶mRNA的結合以轉錄后的方式調控著基因表達，成熟miRNAs通過其5’第2-8個核苷酸(種子序列)與它們的靶mRNAs的3’-UTR內的互補位點結合而識別其靶mRNAs，通過使其靶mRNAs的翻譯抑制或降解來抑制基因表達，它們己成為基因表達的重要調節(jié)因子。功能學研究表明miRNAs參與調控著細胞

6、的增殖、分化和死亡。有研究提示，在腫瘤細胞中miRNAs存在著異常的表達或突變，這表明miRNAs可能成為一類新的原癌基因或抑癌基因。鑒于miRNAs在腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展的作用，通過干預腫瘤細胞內miRNAs的水平來進行腫瘤的治療的策略逐漸形成。就與HER2基因相關的miRNAs而言，有研究提示在小葉癌和導管癌HER2陽性和HER2陰性標本的對比中并未發(fā)現有miRNAs的異常改變，另一近期的研究表明在193例原發(fā)的乳腺癌組織中miRNAs

7、表達譜的測定中未發(fā)現特異性的miRNAs與腫瘤分期、血管浸潤、Her2表達相關。因此作用于HER2基因的天然miRNAs目前并未有確切的研究結果。在本文中，我們應用生物信息學的方法選定兩個不同保守性的與HER23’-UTR有互補結合位點的miRNAs: miR-548d-3p、miR-559，隨之應用ThepMIR_REPORTTM miRNAs表達報告載體進行驗證，即當特定的miRNAs與重組載體上的目標mRNA結合時，能阻斷其蛋白的

8、表達，進而降低其熒光素酶的活性。 因此本課題的目的之三是初步研究miR-559和miR-548d-3p在參與調控HER2基因表達方面的作用，為HER2基因分子靶向治療提供一定的基礎數據。 研究方法： 1.應用免疫組織化學法(IHC)分別檢測52例人乳腺癌組織中HER2蛋白、ER蛋白、PR蛋白的表達。應用熒光原位雜交(FISH)的方法檢測52例人乳腺癌組織中HER2基因的表達，以及17號染色體的表達。 2.

9、收集乳腺癌病例的臨床資料：絕經年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、術后分期等。 3.應用統(tǒng)計學方法分析HER2基因與HER2蛋白、預后因素、激素受體表達的關系；分析17號染色體倍體性與HER2基因、HER2蛋白，預后因素、激素受體表達的關系。 4.用生物信息學的方法預測與HER23’-UTR有互補結合位點的miRNAs并計算其自由能(△G):本課題中通過生物信息學的方法，選取miR-559和m1R-548d-3p作為我們的目的m

10、iRNAs。采用mFold Software分析HER23’-UTR與miR-559、miR-548-3p互補結合位點5’端與3’端各70個核苷酸序列的自由能，從而預測此位點的可接近性。 5.重組質粒的構建：將618bp的HER23’-UTR的基因序列；611bp的缺失了miR-559種子位點(TTACTTT)的HER23'-UTR基因序列；611bp的缺失了miR-548-3p種子位點(GTTTTTA)的HER23'-UTR基

11、因序列亞克隆到pMIR-Luc載體中熒光素酶基因開放閱讀框的下游，并通過測序來驗證其方向性和正確性。 6.轉染和熒光素酶活性的檢測：上述不同的重組載體與β-gal對照載體，以及相應濃度的不同的miRNAs前體一同轉染入Hela細胞，不同的miRNAs前體包括陰性對照前體、m1R-559前體、miR-548d-3p或m1R-559加上-548d-3p前體；轉染后48小時檢測熒光素酶活性。 研究結論： 1.52例患者

12、中HER2基因過表達的比例為38％。 2.HER蛋白IHC檢測和HER2基因FISH法總體上具有明顯的相關性，但在IHC2+的情況存在結果不一致的現象，而對于IHC2+的患者應進一步作FISH檢測以明確診斷。 3.HER2擴增與乳腺癌不良預后指標有密切相關。 4.52例樣本中乳腺癌非整體性的比例約為44％。 5.17號染色體的表達水平分別與HER2基因及蛋白表達水平呈正相關。 6.17號染色體的表

13、達水平的增高與乳腺癌不良預后指標有密切相關。 7.miR-548d-3p和miR-559兩個miRNAs均能分別與HER2基因的mRNA的3'-UTR起到特異性的識別和結合作用，進而翻譯抑制重組載體熒光素酶蛋白的表達，降低熒光素酶的活性，且其效力與轉染的miRNAs前體的濃度呈正相關。而miR-548d-3p和miR-559兩個miRNAs聯合共轉染后明顯地表現出高于其中一個單獨轉染的協同地翻譯抑制作用。由此初步證實miR-54