醫(yī)用臭氧抑制腰椎間盤突出癥中異常自身免疫應答的實驗研究.pdf

1、臭氧（Ozone,O3）由三個氧原子組成，是氧分子（Oxygen,O2）的同素異形體。作為已知可利用的最強的氧化劑之一，其氧化能力在自然界僅次于氟。醫(yī)用臭氧（Oxygen-Ozone,O3-O2）是以醫(yī)用純氧為原料制成的臭氧和氧氣的混合物，可在氣相條件下或溶解于水中發(fā)揮作用，其有效成分是臭氧。近十幾年來，西歐一些國家采用椎間盤內(nèi)和椎旁間隙注射醫(yī)用臭氧的方法治療腰椎間盤突出癥取得良好的療效，國內(nèi)多家醫(yī)療單位也開展了此項技術。關于腰椎間盤突

2、出癥的發(fā)病機制，目前多數(shù)學者都傾向于髓核引發(fā)的自身免疫學說，但關于該學說在動物模型上的驗證還不夠充分和詳實；同時對于醫(yī)用臭氧注射對腰椎間盤突出癥中異常自身免疫應答的影響還欠缺相關的動物實驗研究。 目的：在大鼠身上建立非機械壓迫性腰椎間盤突出癥模型，以醫(yī)用純氧為陰性對照，運用行為學、組織病理學評價醫(yī)用臭氧對該模型的影響，并運用透射比濁法、間接ELISA法、免疫組織化學染色以及MTT法觀察醫(yī)用臭氧對該模型中外周血免疫球蛋白IgG和I

3、gM、抗髓核自身抗體、局部抗原抗體復合物以及特異性T淋巴細胞增殖能力的影響作用，從而探討醫(yī)用臭氧對腰椎間盤突出癥中自身免疫應答的影響。 方法： 1.分組和模型建立：將50只SD大鼠隨機分為五組，每組10只。A組正常對照組：切除鼠尾，行L4～L5間隙硬膜外穿刺，分別注射0.5ml生理鹽水注射液和2％利多卡因注射液30μl；B組（模型對照組），C組（醫(yī)用臭氧組），D組（醫(yī)用純氧組）：均按非機械壓迫性腰椎間盤突出癥模型建立方法

4、造模[1]。E組(抗原制備組）:暫不作處理，常規(guī)飼養(yǎng)。 2.第二次穿刺并注射干預：于模型建立后第14天分組處理：A組及B組:行L4/5硬膜外穿刺，分別注射0.5ml生理鹽水注射液和2％利多卡因注射液30μl；C組：行L4/5硬膜外穿刺，分別注射0.5ml醫(yī)用臭氧氣體（濃度為30 μg/ml）和2％利多卡因注射液30μl；D組：行L4/5硬膜外穿刺，分別注射0.5ml醫(yī)用純氧氣體和2％利多卡因注射液30μl；E組:暫不做處理，常規(guī)

5、飼養(yǎng)。 3.模型建立前一天,模型建立后的一周，兩周（注射干預前），注射干預后一周（處死前）分別對A、B、C、D組大鼠進行爬坡試驗測定；模型建立前一天，模型建立后的第3，6，9，12天，注射干預后第1天，4天，7天（處死前）分別對A、B、C、D組大鼠進行后肢機械刺激縮爪閾值測定。 4.第二次穿刺并注射干預后第7天將E組大鼠尾椎髓核取出利用勻漿后離心取上清的方法得到髓核蛋白抗原，將A、B、C、D組大鼠取外周血檢測免疫球蛋白總

6、IgG,IgM含量，間接ELISA法檢測外周血抗髓核自身抗體含量，取出L4,L5神經(jīng)根作光鏡觀察（HE染色），取出L4,5段椎管內(nèi)組織作免疫組化染色觀察抗原抗體復合物的沉積，MTT法檢測特異性T淋巴細胞增殖功能。 結(jié)果： 1.模型建立后第14天（第二次穿刺及注射干預前）模型對照組，醫(yī)用臭氧組及醫(yī)用純氧組大鼠表現(xiàn)出活動頻繁、易激惹的現(xiàn)象，爬坡試驗為Ⅲ級，后肢出現(xiàn)較明顯的痛覺過敏（P<0.01），模型建立成功。 2.

7、第二次穿刺及注射干預后第7天，模型對照組及醫(yī)用純氧組仍然表現(xiàn)出活動頻繁、易激惹的現(xiàn)象，爬坡試驗為Ⅲ級，后肢機械縮爪閾值較正常組及注射干預前顯著降低（P<0.01）；醫(yī)用臭氧組有兩只大鼠仍然表現(xiàn)出活動頻繁、易激惹的現(xiàn)象，其余大鼠活動情況較注射干預前明顯好轉(zhuǎn)，爬坡試驗有兩只為Ⅲ級，其余為Ⅳ級，后肢機械縮爪閾值較模型組及注射干預前有明顯增高（P>0.01）。 3.模型對照組與正常組相比，總IgG，IgM含量升高（P<0.05）；醫(yī)用臭

8、氧組與模型對照組相比，其外周血總IgG，IgM含量有統(tǒng)計學意義的降低（P<0.05）,與醫(yī)用純氧組相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。 4.和正常組相比，模型對照組大鼠外周血針對髓核蛋白抗原的自身抗體含量升高（P<0.01）；醫(yī)用臭氧組的自身抗體水平較模型對照組有所降低（P<0.05），與醫(yī)用純氧組相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。 5.造模后，模型對照組和醫(yī)用純氧組大鼠L4,L5神經(jīng)根出現(xiàn)炎性反應，有不同程度的神經(jīng)損害;

9、醫(yī)用臭氧組神經(jīng)根炎性反應較模型對照組明顯減輕，正常細胞較模型對照組多。 6.正常對照組大鼠髓核中無抗原抗體復合物陽性沉積，模型對照組7只大鼠有抗原抗體復合物存在，陽性率為70％，與正常對照組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；醫(yī)用臭氧組兩只大鼠有抗原抗體復合物存在，陽性率為20％，陽性率小于模型對照組（P<0.05）；醫(yī)用純氧組6只大鼠有抗原抗體復合物存在，陽性率為60％，陽性率與模型對照組相比無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

10、 7.和正常組相比，模型對照組大鼠特異性T淋巴細胞增殖能力升高（P<0.05）；醫(yī)用臭氧組和模型對照組相比其特異性T淋巴細胞增殖能力降低（P<0.05），與醫(yī)用純氧組相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。 結(jié)論： 1.本實驗在大鼠身上建立非機械壓迫性腰椎間盤突出癥模型，建模后動物出現(xiàn)活動頻繁易激惹的異常情況，后肢出現(xiàn)肌力下降及明顯的痛覺過敏，神經(jīng)根有較明顯的炎性反應，模型建立成功。 2.本實驗通過自身免疫相關指標檢