基因芯片檢測(cè)大鼠心肌頓抑相關(guān)基因的差異表達(dá)及左心室注射地爾硫卓對(duì)頓抑心肌功能的影響.pdf

1、心肌頓抑是一種常見(jiàn)的臨床現(xiàn)象，1975年Heyndrickx等首次描述了這種心肌缺血后收縮功能障礙延遲恢復(fù)的現(xiàn)象，1982年Braunwald等明確提出心肌頓抑的概念。開(kāi)始僅僅認(rèn)為心肌頓抑是一種實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)象未引起重視，但在二十世紀(jì)九十年代之后，缺血性心臟病人通過(guò)各種方式可以獲得冠狀動(dòng)脈的再通，因此對(duì)這種現(xiàn)象的研究成為熱點(diǎn)。
　　 多年來(lái)人們選擇不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法對(duì)其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探討，但機(jī)制仍不清楚，主要的機(jī)制認(rèn)為與氧自由基、肌鈣

2、蛋白降解及鈣假說(shuō)有關(guān)。早有大量研究證明缺血再灌注可以誘導(dǎo)基因表達(dá)的改變，而這種改變正是心肌頓抑的分子學(xué)基礎(chǔ)。了解心肌頓抑時(shí)有哪些基因的表達(dá)改變，不僅可以揭示缺血再灌注所導(dǎo)致的心肌頓抑的分子學(xué)機(jī)制，還可以通過(guò)靶目標(biāo)基因的基因治療抑制心肌頓抑的機(jī)械功能障礙而發(fā)揮心肌頓抑自我修復(fù)功能，這可能是今后缺血性心臟病治療的突破口。雖然有各種針對(duì)心肌頓抑的基因表達(dá)改變的研究，但往往局限于幾個(gè)或數(shù)十個(gè)，對(duì)大量基因表達(dá)改變的研究需要新的方法學(xué)，基因芯片是伴

3、隨著人類基因組計(jì)劃發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高通量篩選技術(shù)，它能在同一實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)篩檢數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的基因的差異表達(dá)，因此，基因芯片技術(shù)的高效性和可靠性為研究心肌頓抑相關(guān)基因的表達(dá)變化提供了新的技術(shù)手段。
　　 心肌頓抑的特點(diǎn)在于其潛在的可恢復(fù)性，因此有人認(rèn)為治療一個(gè)可能自我痊愈的病理生路過(guò)程沒(méi)有必要。但研究證明反復(fù)的心肌頓抑可以引起心肌冬眠，并從而導(dǎo)致心力衰竭，因此及時(shí)有效地治療心肌頓抑對(duì)預(yù)防慢性心力衰竭的形成和發(fā)展是有重大意義的。多數(shù)研究

4、已經(jīng)證實(shí)，再灌注時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心肌頓抑的主要原因。目前，預(yù)防細(xì)胞內(nèi)鈣超載的有效藥物之一是鈣拮抗劑。地爾硫卓是一類能選擇性地阻滯Ca2+經(jīng)細(xì)胞膜上慢鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，另外，地爾硫卓作為鈣拮抗劑可作用于外周血管平滑肌使血管舒張，降低血管阻力，減輕后負(fù)荷，使心輸出量增加，心肌的氧耗減少，減輕心肌頓抑。因此鈣離子拮抗劑有望逆轉(zhuǎn)這種異常從而治療心肌頓抑。
　　 研究目的
　　 探討心肌頓抑的差異表達(dá)

5、基因，分析其功能以探討心肌頓抑可能的分子學(xué)機(jī)制以便為今后的基因治療提供目標(biāo)基因；觀察鈣拮抗劑地爾硫卓不同時(shí)間左心室直接注入對(duì)大鼠心肌頓抑的療效。
　　 研究方法
　　 1.采取大鼠開(kāi)胸前降支結(jié)扎20分鐘再灌注120分鐘方法制造心肌頓抑模型；
　　 2.取大鼠頓抑及假手術(shù)組前壁心肌提取總RNA，采用北京博奧生物有限公司的27K Rat Genome Array芯片掃描觀察差異表達(dá)的基因。
　　 3.選擇基因

6、芯片差異表達(dá)倍數(shù)高的基因進(jìn)行熒光PCR驗(yàn)證確定芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
　　 4.應(yīng)用地爾硫卓在缺血前、再灌注即刻、再灌晚期左心室注射觀測(cè)其對(duì)頓抑大鼠心肌功能的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.大鼠心肌頓抑模型的制造。
　　 心肌頓抑組與假手術(shù)組比較在缺血及再灌注后出現(xiàn)心率增快，LVSP、LVDP、LV±dp/dtmax降低，心肌酶無(wú)明顯升高。
　　 2.心肌頓抑時(shí)基因表達(dá)的變化
　　 基因芯片

7、檢測(cè)頓抑組與假手術(shù)組心肌差異表達(dá)的基因有292條，其中199條上調(diào)，93條下調(diào)。為便于進(jìn)一步分析基因功能及意義，我們進(jìn)一步以4倍差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)篩選出表達(dá)豐度較高的基因41條，以芯片中表達(dá)倍數(shù)較高的HSP70、PAI-1、ATF-3、c-FOS與看家基因GADPH做對(duì)照，用RT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在RT-PCR驗(yàn)證中表達(dá)倍數(shù)雖然不相同，但兩者總體的表達(dá)趨勢(shì)是相同的，認(rèn)為芯片的篩查結(jié)果是可靠的。其中上調(diào)幅度最大為23.1倍，進(jìn)一步提高篩選標(biāo)準(zhǔn)后

8、表達(dá)下調(diào)的基因無(wú)入選。對(duì)表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行功能分類有以下幾種：1、熱休克蛋白。2、立即早期基因。3、生長(zhǎng)因子。4、凋亡相關(guān)基因。5、其他如炎癥相關(guān)因子。
　　 3.地爾硫卓不同時(shí)間點(diǎn)左心室注射對(duì)頓抑心肌功能的影響
　　 與假手術(shù)組比較，其他各組在缺血及再灌注20分鐘后均出現(xiàn)心率增快，LVSP、LVDP、LV±dp/dtmax降低(P<0.05)；與心肌頓抑組比較，缺血期注射地爾硫卓組再灌注60分鐘時(shí)LV±dp/dtmax

9、明顯改善(P<0.05)，再灌注90分鐘時(shí)LVSP、LVDP明顯改善(P<0.05)，至再灌注120分鐘時(shí)LV±dp/dtmax基本恢復(fù)至缺血前水平；而再灌注早期注射地爾硫卓組在再灌注90分鐘LV±dp/dtmax明顯改善(P<0.05)，再灌注120分鐘時(shí)LVSP、LNDP明顯改善(P<0.05)；而再灌注晚期注射地爾硫卓組在再灌注后INSP、LVDP、LV±dp/dtmax無(wú)明顯改善(P>0.05)。
　　 結(jié)論