炎癥在十二指腸空腸旁路術(shù)緩解2型糖尿病中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分,2型糖尿病大鼠及十二指腸空腸旁路術(shù)動物模型的建立及評價
　　背景：
　　糖尿病是最常見的慢性病之一，其中2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus，T2DM)占90％以上。2011年，全球糖尿病患者總數(shù)達3.66億，而且隨著經(jīng)濟發(fā)展及城鎮(zhèn)化的進展，人們生活方式的改變，糖尿病患者在不斷增長，到2030年，糖尿病患者預(yù)計可達5.52億，新增患者主要集中在中低收入國家。飲食控制、運動、口服降糖藥物及注射胰

2、島素等傳統(tǒng)治療方法雖能在短期內(nèi)控制血糖及其他代謝指標(biāo)，由于需終生服藥或注射胰島素，患者依從性差，維持長期血糖控制的效果并不理想。減重手術(shù)在有效治療病態(tài)肥胖的同時，可以有效緩解肥胖并發(fā)的高血壓、高血脂、T2DM等代謝性并發(fā)癥。研究表明，減重手術(shù)對T2DM的緩解不單單依靠其減重作用，尚存在不依賴于減重的抗糖尿病作用。雖然大量的臨床研究及動物實驗證實了胃旁路術(shù)對T2DM的長期、有效的治療作用，對其緩解T2DM機制的研究形成“近端小腸假說”、“

3、遠(yuǎn)端小腸假說”等理論，但其分子機制目前仍不清楚。
　　目的：
　　本研究旨在建立一種新的T2DM大鼠模型，并對其實行十二指腸空腸旁路術(shù)(Duodenal-jejunalbypass，DJB)，以其做為胃旁路術(shù)的模型，對胃旁路術(shù)不依賴于減重作用的緩解T2DM的機制進行研究。本研究主要對以下問題進行研究:(1)對建立的T2DM大鼠模型進行評估，確定建立的模型能模擬人T2DM的特點;(2)評估DJB對T2DM大鼠糖代謝的影響，在本

4、模型中驗證其對糖代謝的改善作用;(3)在本模型中評估DJB對T2DM大鼠血脂指標(biāo)的影響;(4)評估DJB對T2DM大鼠腸道激素的影響，對其改善糖代謝的機制進行進一步研究。
　　方法：
　　本研究中應(yīng)用高脂飼料(High fat diet，HFD)喂養(yǎng)SD大鼠1個月誘導(dǎo)胰島素抵抗，然后給予低劑量(35mg/kg)的鏈脲佐菌素(Strep to zotocin，STZ)腹腔注射誘導(dǎo)高血糖，此模型很好的模擬了人T2DM的發(fā)病過程及

5、代謝特點。DJB保留了胃的完整性，其小腸重建方式與Roux-en-Y胃旁路術(shù)(Roux-en-Ygastric bypass，RYGB)相同，對體重及攝食量沒有影響，是目前用來研究胃旁路術(shù)不依賴于減重作用的抗糖尿病機制的良好模型。對成功誘導(dǎo)出T2DM的大鼠進行DJB及假手術(shù)（Sham-DJB，S-DJB），以正常SD大鼠作為空白對照(CON)，并檢測以下指標(biāo):(1)血糖:每周檢測其空腹血糖及隨機血糖;(2)糖耐量:在術(shù)后2，4，8，12

6、周進行口服葡糖糖耐量實驗(Oral glucose tolerance test，OGTT)進行檢測;(3)胰島素敏感性:在術(shù)前及術(shù)后2周、12周以胰島素耐量實驗(Insulin tolerance test，ITT)進行檢測;(4)β細(xì)胞功能:以術(shù)前及術(shù)后2周、12周檢測葡萄糖刺激的胰島素分泌進行評估;(5)腸道激素:檢測術(shù)后2周、12周葡萄糖刺激的胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-likepeptide-1，GLP-1)、肽YY

7、(PeptideYY，PYY)及葡萄糖依賴性促胰島素肽(Glucosedependent insulinotro picpeptide，GIP)的變化;(6)血脂指標(biāo):檢測術(shù)后12周血清甘油三酯、總膽固醇、游離脂肪酸的變化。
　　結(jié)果：
　　(1)HFD聯(lián)合小劑量STZ成功誘導(dǎo)出T2DM大鼠模型，模擬了人T2DM胰島素抵抗（葡萄糖刺激的胰島素水平升高及AUCITT升高）及高血糖（開始主要表現(xiàn)為隨機血糖的升高，空腹血糖逐步升高

8、）的特點。
　　(2)DJB組與S-DJB組大鼠的體重及能量攝入在術(shù)前及術(shù)后均無顯著性差異（*P＞0.05）。
　　(3)DJB可迅速、持久的緩解T2DM大鼠的隨機血糖（*P＜0.05）;S-DJB組大鼠的空腹血糖逐步升高，而DJB大鼠的空腹血糖保持在正常水平。
　　(4)DJB可迅速、持久的改善T2DM大鼠的糖耐量，術(shù)后2周DJB組大鼠糖耐量即明顯改善（AUCoGTT明顯下降，*P＜0.05），術(shù)后4周進一步改善，并

9、達到與CON組相近水平。
　　(5)DJB可迅速改善T2DM大鼠的胰島素敏感性，DJB術(shù)后2周胰島素敏感性即明顯改善（AUCITT明顯下降，*P＜0.05）;術(shù)后12周DJB組大鼠胰島素敏感性進一步改善，而S-DJB組大鼠胰島素敏感性進一步惡化，二者AUCITT差異更加明顯。
　　(6)高脂飼料喂養(yǎng)1個月后，SD大鼠出現(xiàn)高胰島素血癥。STZ腹腔注射后，胰島素水平下降，但并未出現(xiàn)胰島素缺乏，其水平與正常對照組水平相近。3組大鼠

10、術(shù)后2周及12周葡糖糖刺激的胰島素分泌無顯著性差異。
　　(7)術(shù)后2周及12周，DJB組大鼠葡糖糖刺激的GLP-1、PYY水平明顯升高（*P＜0.05），而3組大鼠葡糖糖刺激的GIP水平無明顯差異（*P＞0.05）。
　　(8)3組大鼠總膽固醇無顯著性差異（*P＞0.05）;與S-DJB組大鼠相比，DJB組大鼠的甘油三酯及游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FA）水平明顯降低(*P＜0.05)。
　　結(jié)論

11、：
　　(1)通過高脂飼料喂養(yǎng)1個月聯(lián)合低劑量STZ(35mg/kg)可以成功誘導(dǎo)T2DM大鼠模型，此模型符合人類T2DM的發(fā)病過程及代謝特點;
　　(2)DJB對T2DM大鼠的可迅速、顯著、持久的改善T2DM大鼠的隨機血糖，阻止空腹血糖的升高;
　　(3)DJB可迅速改善T2DM大鼠的糖耐量及胰島素敏感性，而對葡萄糖刺激的胰島素分泌無明顯影響;
　　(4)DJB手術(shù)后，葡萄糖刺激的主要由遠(yuǎn)端小腸分泌的GLP-1

12、、PYY顯著升高，GIP分泌量與術(shù)前相比無明顯差別;
　　(5)DJB手術(shù)可以顯著降低T2DM大鼠的FFA及甘油三酯水平。
　　本部分研究表明，DJB可以迅速、持久的改善T2DM大鼠的糖代謝。其對糖代謝的改善作用可能與GLP-1、PYY等腸道激素的水平升高有關(guān)。但其作用方式及機制目前仍不清楚，在下一步的研究中，我們將對其作用機制進行深入研究。
　　第二部分,十二指腸空腸旁路術(shù)對T2DM大鼠炎癥狀態(tài)的影響
　　背景

13、：
　　T2DM的發(fā)生的主要是由胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能障礙引起，然而其具體機制目前仍不明確。近年來，炎癥假說備受關(guān)注，尤其是炎癥在胰島素抵抗中的作用。大量研究表明，T2DM是一種自然免疫與低度炎癥性疾病。肥胖是T2DM最重要的危險因子。肥胖時機體處于一種慢性低度炎癥狀態(tài)，表現(xiàn)為循環(huán)中炎癥介質(zhì)水平升高，如腫瘤壞死因子-alpha（Tumor necrosis factor-α，TNF-α），白介素-6(Inter leukin-

14、6，IL-6)，C反應(yīng)蛋白(Creactivep rotein，CRP)等。研究表明，這種慢性低度炎癥狀態(tài)主要起源于脂肪組織。脂肪組織不僅僅是一個儲存脂質(zhì)的器官，近年來的研究表明脂肪組織還是一個內(nèi)分泌器官。作為一個內(nèi)分泌器官，脂肪組織可以分泌多種激素及細(xì)胞因子，他們在調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝、凝血、饑餓及飽腹感等信號通路中起到至關(guān)重要的作用。脂肪組織分泌的細(xì)胞因子及趨化因子，統(tǒng)稱為脂肪因子(adipokines)或脂肪細(xì)胞因子(adipocy

15、tokines)，如瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)、TNF-α、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等。減重手術(shù)是目前治療病態(tài)肥胖最有效的治療方式。研究報道RYGB術(shù)后血清hsCRP水平降低。還有研究報道，減重手術(shù)后脂肪組織及肝臟組織中炎癥因子mRNA表達水平下降。大多數(shù)研究都將機體炎癥狀態(tài)的緩解歸結(jié)為體重減輕的結(jié)果。然而，有研究表明，RYGB

16、術(shù)后促炎癥因子水平的降低、抗炎癥因子水平的升高與體重下降的幅度不相關(guān)。胃旁路術(shù)后機體炎癥狀態(tài)的緩解是否亦存在不依賴于體重減輕的機制，機體炎癥狀態(tài)的緩解與T2DM的緩解是否存在相關(guān)性，需要進一步的研究。
　　目的：
　　近年來的研究表明，脂肪組織不單單是能量儲存器官，亦是一個內(nèi)分泌器官。脂肪組織可以分泌大量的細(xì)胞因子及趨化因子。脂肪組織，特別是內(nèi)臟脂肪組織，是肥胖狀態(tài)下機體慢性炎癥狀態(tài)下促炎癥因子的主要來源。除脂肪組織外，肥胖

17、狀態(tài)下，肝臟組織存在大量的脂肪浸潤及炎癥細(xì)胞的浸潤，是機體慢性炎癥狀態(tài)的另一個重要來源。肝臟組織與脂肪組織又是機體糖代謝的重要器官。脂肪組織、肝臟炎癥水平是胰島素抵抗發(fā)生的重要原因。本研究旨在明確DJB對T2DM大鼠機體脂肪分布、肝臟脂肪浸潤、脂肪組織炎癥細(xì)胞浸潤及機體炎癥狀態(tài)等的影響，并明確機體炎癥狀態(tài)的變化與胰島素敏感性的關(guān)系，以揭示DJB緩解T2DM的機制。
　　方法：
　　本部分研究中，我們利用第一部分中取得的血液及

18、組織樣本，對以下指標(biāo)進行檢測:(1)機體炎癥狀態(tài)的變化:用術(shù)后12周取得的血液樣本，對血清中血清瘦素、脂聯(lián)素、超敏型C-反映蛋白(high sensitive C-reactive protein，hsCRP)、TNF-α、IL-6等脂肪因子以ELISA方法進行檢測;(2)機體脂肪組織分布的變化:對手術(shù)后12周取得的各部位的脂肪組織稱重，計算其與體重的比例，觀察不同部位脂肪沉積的變化;(3)脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤的變化:進行免疫組織化學(xué)

19、染色檢測腹膜后脂肪組織中F4/80陽性細(xì)胞的變化，并分離脂肪組織基質(zhì)血管組分行實時熒光定量PCR檢測Mac-1、F4/80、CD68等巨噬細(xì)胞標(biāo)志物進一步確認(rèn)脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤的多少;(4)肝臟組織脂肪浸潤的變化:以油紅O染色檢測肝組織中脂肪浸潤的變化;(5)脂肪組織炎癥狀態(tài)的變化:內(nèi)臟脂肪組織瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6、白介素1β(Interleukin-1beta，IL-1β)、MCP-1等mRNA表達的變化，以實時熒光

20、定量定量PCR進行檢測;(6)肝臟組織炎癥狀態(tài)的變化:肝臟組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1等mRNA的變化，以實時熒光定量定量PCR進行檢測。
　　結(jié)果：
　　(1)S-DJB組大鼠血清中瘦素、hsCRP、IL-6較CON組明顯升高，而DJB手術(shù)可以明顯降低這些炎癥因子的水平（*P＜0.05）;S-DJB組大鼠血清中抗炎性脂肪因子脂聯(lián)素水平較CON組明顯降低，DJB手術(shù)可以明顯上調(diào)其水平（*P＜0.05）。<

21、br>　　(2)DJB術(shù)后12周，3組大鼠附睪周圍脂肪及腹股溝區(qū)脂肪與體重的比例無顯著性差異，而DJB組大鼠內(nèi)臟脂肪組織大網(wǎng)膜及腹膜后脂肪組織占體重的比例較S-DJB組大鼠明顯降低（*P＜0.05）。
　　(3)與S-DJB組相比較，DJB術(shù)后12周，肝臟組織脂肪浸潤明顯減少。
　　(4)與S-DJB組相比較，DJB術(shù)后12周，腹膜后脂肪組織中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80陽性的細(xì)胞明顯減少，血管基質(zhì)組分中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Mac-3

22、、CD68、F4/80mRNA表達量明顯降低（*P＜0.05）。
　　(5)與S-DJB組相比較，DJB術(shù)后12周，內(nèi)臟脂肪組織瘦素、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1等促炎性脂肪因子mRNA表達水平顯著下降（*P＜0.05），抗炎性脂肪因子脂聯(lián)素mRNA表達水平明顯升高（*P＜0.05）。
　　(6)與S-DJB組相比較，DJB術(shù)后12周，肝臟組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1等mRNA表達水平明顯

23、降低（*P＜0.05）。
　　(7)DJB術(shù)后12周，炎癥因子的表達水平與GLP-1表達量呈負(fù)相關(guān)，與AUCITT呈正相關(guān)，與體重、進食量、胰島素水平等因素?zé)o相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　本部分的研究結(jié)果表明:
　　(1)DJB手術(shù)后12周，T2DM大鼠循環(huán)中炎癥因子水平降低，抗炎性脂肪因子-脂聯(lián)素水平升高;
　　(2)DJB手術(shù)后12周，T2DM大鼠的內(nèi)臟脂肪含量降低，肝臟脂肪浸潤明顯減少;
　　(3)

24、DJB手術(shù)后12周，內(nèi)臟脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤減少。
　　(4)DJB手術(shù)后12周，內(nèi)臟脂肪組織中炎癥因子的mRNA表達水平降低，內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達水平升高;
　　(5)DJB手術(shù)后12周，肝臟組織中炎癥因子的mRNA表達水平明顯降低;
　　(6)相關(guān)性分析顯示，機體炎癥狀態(tài)的改善與胰島素敏感性的改善存在相關(guān)性，與GLP-1水平的升高也存在相關(guān)性。
　　第三部分,十二指腸空腸旁路術(shù)對T2DM大鼠JN

25、K活性及胰島素信號通路的影響
　　背景：
　　胰島素受體底物(Insulin receptor substrates，IRSs)是胰島素信號通路的重要調(diào)節(jié)因子。在正常情況下，胰島素與其受體的結(jié)合引起胰島素受體構(gòu)型的變化，這種變化引起胰島素受體胞質(zhì)域特定酪氨酸殘基的磷酸化，進而引起調(diào)節(jié)蛋白IRSs的聚集。與IRS作用后，PI3K被激活。酪氨酸磷酸化是IRSs激活和胰島素敏感性所必須的，這種作用可被IRSs絲氨酸磷酸化所阻滯。T

26、NF-α與其受體結(jié)合，可以激活色氨酸激酶如c-JunN-末端激酶(c-JunN-terminalkinase，JNK)及色氨酸激酶抑制物κB激酶(serinekinaseinhibitorκBkinase，IKK)等。這些色氨酸激酶可以引起IRSs色氨酸的磷酸化，阻滯胰島素信號通路的傳導(dǎo)，引起胰島素抵抗。近年來的研究表明T2DM是一種慢性炎癥性疾病。炎癥因子及游離脂肪酸可以激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，如JNK、IKKβ等。這些信號通路在胰島素抵

27、抗及T2DM的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。JNK可以使胰島素受體底物307位的絲氨酸(Ser307)發(fā)生磷酸化，而其正常的酪氨酸磷酸化受到抑制，而影響下游胰島素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明RYGB可以上調(diào)肥胖T2DM大鼠肝臟胰島素受體、IRS及其酪氨酸磷酸化的表達。本課題組的一項研究表明DJB可以上調(diào)GK大鼠肝臟胰島素信號相關(guān)蛋白的表達。然而，目前還沒有DJB對JNK及IRSsSer307磷酸化表達水平影響的報告，也沒有其在DJB術(shù)后胰島素

28、敏感性改善中的作用及機制的報道。
　　目的：
　　我們的前期研究已表明DJB術(shù)后機體的慢性炎癥狀態(tài)得到改善，血清、內(nèi)臟脂肪、肝臟的炎癥因子表達水平均顯著下降，而且其慢性炎癥狀態(tài)的改善與胰島素敏感性的改善呈正相關(guān)關(guān)系。因為炎癥因子可以激活胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號通路，在調(diào)節(jié)胰島素敏感性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。我們在本部分研究中將對內(nèi)臟脂肪組織及肝臟組織JNK活性進行檢測，并對其相關(guān)的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白進行研

29、究，以明確其在DJB術(shù)后炎癥狀態(tài)的改善對胰島素敏感性影響。
　　方法：
　　應(yīng)用第一部分中取得的組織樣本，以Westernblotting技術(shù)對以下指標(biāo)進行檢測:(1)內(nèi)臟脂肪組織中JNK、p-JNK的表達變化;(2)內(nèi)臟脂肪組織中總IRS-1及IRS-1p-ser307的表達;(3)肝臟中JNK、p-JNK的表達變化;(4)肝臟組織中總IRS-2及IRS-2p-ser307的表達;(5)以免疫共沉淀技術(shù)檢測肝臟組織及內(nèi)臟脂

30、肪組織中IRS1/2結(jié)合的PI3K的變化。
　　結(jié)果：
　　(1)與S-DJB組相比，DJB組大鼠內(nèi)臟脂肪組織中JNK表達有下降趨勢，但并未達到顯著性差異（P＞0.05），但p-JNK/JNK比例明顯下降（*P＜0.05）。
　　(2)與S-DJB組相比，DJB組大鼠內(nèi)臟脂肪組織中IRS-1的表達量無顯著性差異(P＞0.05)，然而IRS-1p-ser307/IRS-1比例明顯下降（*P＜0.05）。
　　(3)

31、與S-DJB組相比，DJB組大鼠肝臟組織中JNK及p-JNK的表達水明顯平均下降（*P＜0.05）。
　　(4)與S-DJB組相比，DJB組大鼠肝臟組織中IRS-1表達明顯升高（*P＜0.05），而IRS-1p-ser307/IRS-1比例明顯下降（*P＜0.05）。
　　(5)與S-DJB組相比，DJB組大鼠內(nèi)臟脂肪組織及肝臟組織中IRS-1/2結(jié)合的PI3K水平均明顯升高（*P＜0.05）。
　　結(jié)論：