紅霉素及其衍生物治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可行性研究.pdf

1、紅霉素及其衍生物治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可行性研究前言紅霉素(erythromycin，EM)是臨床廣泛應(yīng)用的十四元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，它除具有抗菌活性外，還有多種藥理活性，其中包括抗炎活性。臨床實(shí)踐證明，長(zhǎng)期應(yīng)用小劑量紅霉素治療彌漫性泛細(xì)支氣管炎(diffusepanbron-chiolitis，DPB)取得了良好療效，而且人們確信這種作用不是由于其抗菌活性而應(yīng)歸因于它的抗炎活性。不僅如此，紅霉素還可用于諸如慢性支氣管炎和支氣管哮喘等呼吸道疾

2、病的治療。盡管近年來(lái)關(guān)于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素抗炎活性報(bào)道頻繁，但用該類(lèi)藥物治療除呼吸道炎癥之外的其它炎癥疾病卻并未引起人們的重視。 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是慢性多關(guān)節(jié)疾病，主要表現(xiàn)滑膜組織過(guò)度增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。這種滑膜組織的過(guò)度增生伴隨著關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，最終導(dǎo)致患者殘疾。取自RA患者的T淋巴細(xì)胞和滑液細(xì)胞可分泌核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化子配體(receptoractivatorofNF-κB

3、ligand，RANKL)，RANKL可促使造血祖細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，引起RA的骨破壞，T淋巴細(xì)胞所分泌的RANKL是引發(fā)RA關(guān)節(jié)損傷的主要原因。因此可以推測(cè)從阻斷RANKL的角度去治療RA將是有意義的。最近的研究表明，T淋巴細(xì)胞除產(chǎn)生RANKL外，還可產(chǎn)生白介素-17(interleukin，IL-17)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophage-colonystimu-latingfactor，GM-C

4、SF)等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子對(duì)破骨細(xì)胞形成也有非常強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，因此，T淋巴細(xì)胞在RA的發(fā)病機(jī)制中所發(fā)揮的作用越來(lái)越得到人們的關(guān)注。 核轉(zhuǎn)錄因子(nuclearfactorkappaB，NF-κB)可調(diào)控多種炎性細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄。它與NF-κB的抑制蛋白(inhibitorynuclearfactor-kappaB，IκB)結(jié)合以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞漿中，IκB的磷酸化和降解使得NF-κB與IκB解離，導(dǎo)致NF-κB的活化

5、，從而促使炎癥反應(yīng)中許多細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄；同時(shí)研究表明NF-κB的活化可以阻斷細(xì)胞的凋亡。RANKL的活化可引起NF-κB的表達(dá)增加。 鑒于T淋巴細(xì)胞所分泌的RANKL和NF-κB在炎癥反應(yīng)中的重要作用，我們開(kāi)展了一系列的實(shí)驗(yàn)研究，以考察紅霉素及其無(wú)抗菌活性的紅霉素衍生物對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖和RANKL與NF-κB表達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)方法1.用含10％FBS的1640培養(yǎng)液體外培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞株，分別加入四種濃度(3.0μg/mL

6、、10.0μg/mL、30.0μg/mL和100.0μg/mL)的紅霉素及其9種衍生物培養(yǎng)24小時(shí)，采用MTr法，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570值，計(jì)算出各個(gè)化合物對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制率，進(jìn)而得出其IC50值，評(píng)價(jià)十個(gè)化合物對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響并從中篩選出抑制增殖活性突出的化合物。 2.從論文一中篩選出活性較好的N-去甲基紅霉素(Ⅰ)和十二元環(huán)紅霉素衍生物(Ⅷ)并以紅霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的研究。分別加入

7、上述三種化合物(3.0μg/mL、10.0μg/mL、30.0μg/mL和100.0μg/mL)培養(yǎng)24小時(shí)，然后用流式細(xì)胞儀PI染色法觀察T淋巴細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化。同時(shí)利用TUNEL原位缺口末端標(biāo)記法進(jìn)一步確認(rèn)凋亡的存在，其表達(dá)的光密度值利用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。 3.首先用100pMTNF-α誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞1小時(shí)，使之表達(dá)NF-κB，然后利用RT-PCR和Westernblot兩種方法觀察四種濃度(3.0μg

8、/mL、10.0μg/mL、30.0μg/mL和100.0μg/mL)的N-去甲基紅霉素(I)和十二元環(huán)紅霉素衍生物(Ⅷ)以及紅霉素對(duì)T淋巴細(xì)胞NF-κB和RANKLmRNA水平以及蛋白水平表達(dá)的影響。其表達(dá)的灰度值用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。 4.統(tǒng)計(jì)分析：各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用單因素方差分析和相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.MTT法顯示，EM、克拉霉素(

9、CAM)、Ⅰ、ⅣandⅧ抑制T淋巴細(xì)胞增殖活性較明顯。它們各自的IC50值是606.28±35.43、431.62±25.60、367.31±32.60、425.62±32.08、176.38±10.42μM。其中Ⅰ和Ⅷ的IC50值明顯低于EM和CAM。 2.流式細(xì)胞儀和TUNEL兩種方法顯示紅霉素(30.0μg/mL和100.0μg/mL)、Ⅰ(3.0μg/mL、10.0μg/mL和30.0μg/mL)和Ⅷ(30.0μg/mL

10、)有誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡的活性。Ⅷ(從3.0μg/mL至30.0μg/mL)可引起T淋巴細(xì)胞G2/M期周期阻滯并與劑量之間呈正相關(guān)。Ⅰ和Ⅷ在100.0μg/mL時(shí)均導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。3.事先加入EM、Ⅰ和Ⅷ三種化合物的四種劑量(3.0μg/mL、10.0μg/mL、30.0μg/mL和100.0μg/mL)，然后使T淋巴細(xì)胞暴露在100pMTNF-α下1小時(shí)，誘導(dǎo)NF-κB表達(dá)，Westernblot結(jié)果顯示EM、Ⅰ和Ⅷ均有抑制NF-κB

11、和RANKL蛋白表達(dá)的作用，并與劑量之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。在100μg/mL時(shí)EM、Ⅰ、Ⅷ分別使NF-κB降低46％、59％、36％，分別使RANKL降低32％、40％、20％；NF-κB與RANKL二者之間變化有相關(guān)性。 4.RT-PCR結(jié)果顯示EM、Ⅰ和Ⅷ均可抑制NF-κBmRNA和RANKLmRNA表達(dá)，并與劑量之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。在100.0μg/mL時(shí)EM、Ⅰ、Ⅷ分別使NF-κB降低36％、46％、32％，使RANKL降低分別為

12、29％、37％、24％；NF-κB與RANKL二者之間變化有相關(guān)性。 結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅霉素及其衍生物具有抑制T淋巴細(xì)胞增殖和抑制NF-κB與RANKL表達(dá)的作用。此結(jié)果說(shuō)明，紅霉素及其衍生物所具備的抗炎活性可能是通過(guò)作用RANKL信號(hào)途徑抑制NF-κB的活化，進(jìn)而引起T淋巴細(xì)胞的凋亡和周期阻滯的過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。我們首次發(fā)現(xiàn)，RANKL在紅霉素及其衍生物抗炎活性中占有重要的地位，我們的發(fā)現(xiàn)將為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素抗炎機(jī)制研究提供一個(gè)新