HO-1在2型糖尿病大鼠心肌中的表達及其與氧化應(yīng)激相關(guān)性的研究.pdf

1、糖尿病是一組以長期高血糖為主要特征的代謝綜合征，可并發(fā)眼、腎、神經(jīng)、心血管等多臟器的慢性損害。1972年，Rubler等在無明顯冠狀動脈粥樣硬化的糖尿病患者中觀察到一種特異性心肌病變。1974年，Hambyn<'1>等通過進一步病理研究，首次提出了糖尿病心肌病變(diabetic cardiomyopathy DCM)的概念，并認為DCM與DM特有的代謝紊亂有關(guān)。糖尿病心肌病的發(fā)病機制還未完全闡明，已發(fā)現(xiàn)與細胞內(nèi)Ca<'2+>穩(wěn)態(tài)失衡、

2、氧化應(yīng)激、細胞因子和細胞外基質(zhì)的作用、脂肪酸的異常代謝以及血管緊張素的作用等密切相關(guān)。近期的研究提示各種糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的通路可能是由氧化應(yīng)激這一共同機制所激發(fā)，即各種因素(DM時主要為高血糖)導(dǎo)致的線粒體電子傳遞鏈超氧化物產(chǎn)生過量。高血糖使線粒體中過氧化物生成增多，活性氧簇(ROS)使DNA鏈斷裂，并激活聚ADP-核糖基聚合酶，抑制磷酸甘油醛脫氫酶，使糖代謝上游產(chǎn)物不能進入正常的有氧氧化途徑，從而激活了多元醇通路，PKC途徑，AGEs

3、等反應(yīng)通路，產(chǎn)生一系列損害使得心肌產(chǎn)生相應(yīng)的病理改變。 血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)是體內(nèi)參與亞鐵血紅素代謝的一組具有多種功能的微粒體氧化酶，是血紅素代謝的起始酶和限速酶，主要功能是代謝血紅素形成膽綠素，一氧化碳及亞鐵離子，該過程由NADPH提供電子，膽綠素則被膽綠素還原酶進一步還原生成膽紅素。血紅素加氧酶在體內(nèi)存在三種同工酶：H0—1，H0—2，H0—3，分別為不同基因所編碼。H0—1，即誘導(dǎo)型的血紅素加

4、氧酶，其酶促反應(yīng)及產(chǎn)物具有重要的生理意義，在人體內(nèi)起調(diào)節(jié)和保護作用。其產(chǎn)物膽綠XP素和其還原產(chǎn)物膽紅素能清除活性氧，CO具有細胞保護作用，亞鐵離子可誘導(dǎo)鐵蛋白的合成，后者可減少活性氧的產(chǎn)生，是體內(nèi)有效的抵抗氧化應(yīng)激的酶系統(tǒng)。現(xiàn)有的研究表明，ROS誘導(dǎo)的H0-1的活性增加是氧化應(yīng)激的一種普遍標志。H0-1的表達及活性隨著氧化應(yīng)激的增強而增加。Yet SF等<'[64]>研究證明，氧化應(yīng)激時裸鼠發(fā)生心肌細胞損害和發(fā)展為右室梗死，在過度表達

5、不同水平H0-1的心臟特異性轉(zhuǎn)基因大鼠，通過使用langendorff技術(shù)，轉(zhuǎn)基因鼠在缺血/再灌注時心臟收縮功能顯著改善，具有心臟保護作用，并且呈H0-1劑量依賴方式。目前氧化應(yīng)激共同通路已成為糖尿病心肌病變發(fā)病機制重要的研究方向，如何抵抗氧化應(yīng)激，清除氧自由基成為治療糖尿病心肌病變新的目標。H0-1在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下表達，其產(chǎn)物具有抵抗氧化應(yīng)激，清除自由基的作用，對其的深入研究對治療糖尿病心肌病變具有很強的意義。 目的

6、本研究通過給予高脂飲食喂養(yǎng)大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)而建立2型糖尿病大鼠動物模型。觀察建立模型8周后正常對照組、糖尿病未予控制組以及糖尿病經(jīng)硫辛酸治療組大鼠心肌組織的病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變：對比這三組大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激產(chǎn)物的水平；測定H0-1基因及蛋白的表達情況以初步分析： 1)評估2型糖尿病情況下心肌組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物的水平，討論氧化應(yīng)激與糖尿病心肌病變的關(guān)系： 2)觀察糖尿病心肌病變時，H0-1基因與蛋白的表

7、達情況，初步分析其與氧化應(yīng)激的相關(guān)性，為臨床治療提供理論依據(jù)； 試驗方法 實驗動物采用180-220g，雄性Wistar大鼠，隨機分為正常對照組，糖尿病組(D I組)和硫辛酸治療組(D Ⅱ組)。正常對照組給與普通飼料。糖尿病組和硫辛酸治療組給與高脂飼料，喂養(yǎng)8周后按照30mg/Kg體重行一次性STZ腹腔注射。確定成模，穩(wěn)定血糖1周后給予D Ⅱ組大鼠硫辛酸注射液50mg/Kg·day，5日/周，共計6周。之后處死大鼠，處死

8、時心臟取血離心，留取血清進行各項血液指標的檢測，對大鼠心肌冰凍切片進行HE染色，觀察各組大鼠心肌組織的病理改變；利用電鏡觀察各組大鼠心肌組織的超微結(jié)構(gòu)；運用比色法測定過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)水平、RT-PCR方法測定血紅素加氧酶的基因表達情況；免疫組織化學(xué)方法測定血紅素加氧酶-1在心肌組織中的表達情況。統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標準差( +SD)表示，采用SPSSll.0軟件處理。樣本間均數(shù)的比較采用t檢驗，變量間的關(guān)系采用直線

9、相關(guān)分析。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、造模成功后的實驗階段D Ⅰ、DⅡ組糖尿病大鼠體重明顯高于NC組大鼠同期體重，而D Ⅱ組糖尿病大鼠在注射硫辛酸后體重反而下降。兩組大鼠血糖和糖化血紅蛋白(HbAlc)則顯著高于NC組大鼠。 2、免疫組化染色顯示NC組大鼠心肌中可見HO-1陽性染色顆粒，D I組、D Ⅱ組大鼠心肌中HO一1陽性染色顆粒明顯增加，且D I組比DⅡ組增加更明顯。 3、R

10、T—PCR結(jié)果顯示三組大鼠心肌中均含H0—1mRNA。與NC組相比，D I組大鼠心肌組織內(nèi)H0—1mRNA表達增加了24.6％，D Ⅱ組大鼠增加了7.5％，差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p

11、關(guān)系數(shù)為：r=0.831(p<0.05)。 結(jié)論： 1、氧化應(yīng)激是糖尿病高血糖造成心肌組織損傷的重要機制 2、高血糖狀態(tài)下，大鼠心肌組織中丙二醛表達量增加，尤以DⅠ組增加明顯，DⅡ組大鼠由于硫辛酸的治療作用對抗了氧化應(yīng)激，從而丙二醛的表達量較DⅠ組有所下降。 3、糖尿病高血糖狀態(tài)下，大鼠心肌組織中HO-1蛋白表達較正常對照組增加尤以未給予硫辛酸組增加明顯。 4、糖尿病高血糖狀態(tài)下，wi