抗重金屬銅離子mAb的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、銅（Cu）在日常生活中應(yīng)用非常廣泛，是人類和動(dòng)植物體內(nèi)必需的微量元素，但是過量的銅也會(huì)給機(jī)體帶來(lái)很大的危害。針對(duì)重金屬的理化檢測(cè)方法存在費(fèi)用高、樣品前處理繁瑣、不能現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等缺點(diǎn)，其推廣應(yīng)用受到了局限。本論文利用免疫學(xué)技術(shù)旨在制備出抗Cu2+-EDTA單克隆抗體并建立銅離子阻斷ELISA檢測(cè)方法。
　　將銅離子與雙功能螯合劑 ITCBE螯合，形成半抗原，采用異硫氰酯法將其與載體蛋白（BSA、OVA）偶聯(lián)，獲得免疫原Cu2+-I

2、TCBE-BSA和包被原Cu2+-ITCBE-OVA，用UV、ICP-AES、SDS-PAGE等進(jìn)行鑒定，并通過免疫動(dòng)物獲得的Cu2+-EDTA pAb進(jìn)行鑒定，以確定免疫原是否合成成功。結(jié)果表明，免疫原和包被原蛋白濃度分別為9.21 mg/mL和6.25 mg/mL，Cu2+質(zhì)量濃度分別為16.83μg/mL和6.42μg/mL；分子量大于BSA；pAb效價(jià)達(dá)到了1∶（5.12×104），對(duì)Cu2+-EDTA的半數(shù)抑制濃度（IC50）

3、為29.92 ng/mL，與 Zn2+-EDTA的交叉反應(yīng)率（CR％）為27.01％，與其他重金屬螯合物無(wú)交叉反應(yīng)。
　　采用免疫原Cu2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠，通過間接ELISA和阻斷ELISA法篩選細(xì)胞融合備用小鼠，利用細(xì)胞融合技術(shù)制備抗Cu2+-EDTA單克隆抗體。結(jié)果表明，篩選出4株雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1F7、2B8、3G5和3D10。其中2B8株細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體效價(jià)為1∶（1.28×103），

4、腹水抗體效價(jià)為1∶（5.12×105），同種型為IgG1/κ型，親和常數(shù)（Ka）為7.87×1011 L/moL，IC50為29.78 ng/mL，與Zn2+-EDTA的CR％為26％，與其他重金屬螯合物沒有交叉反應(yīng)。
　　采用2B8細(xì)胞株產(chǎn)生的腹水單抗組裝 Cu2+阻斷 ELISA檢測(cè)試劑盒，并利用阻斷ELISA法測(cè)其靈敏度、添加回收試驗(yàn)測(cè)其準(zhǔn)確度、批內(nèi)批間試驗(yàn)測(cè)其精密度、交叉反應(yīng)試驗(yàn)測(cè)其特異性。結(jié)果表明，試劑盒靈敏度為11.9