神經(jīng)干細(xì)胞移植對HIBD新生大鼠Foxg1和p21基因mRNA的影響.pdf

1、背景：
　　 缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是各種原因引起的腦缺氧和腦血流減少或中斷造成大腦水腫及繼發(fā)重構(gòu)，持續(xù)的腦細(xì)胞丟失及腦室周圍和鄰近皮質(zhì)白質(zhì)囊泡化，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞大量丟失，引起相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙，是導(dǎo)致兒童腦性癱瘓的主要原因。近年來隨著新生兒搶救技術(shù)的提高，發(fā)病率逐漸增高。目前中重度HIBD預(yù)后不良，而目前的治療方法療效有限，尋找有效的細(xì)胞重建途徑，替代損傷的神經(jīng)細(xì)

2、胞，是治療HIBD的新的理念和途徑，神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)移植是最近研究的新的治療方法。NSCs是神經(jīng)細(xì)胞的天然前體細(xì)胞，是一類具有多分化潛能的未分化細(xì)胞，移植后在體內(nèi)能夠分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等多種神經(jīng)細(xì)胞，從而發(fā)揮其替代損傷細(xì)胞修復(fù)損傷腦組織的作用。NSCs可以從哺乳動物的胎腦、臍血、臍帶、骨髓、胎腦、胎盤羊膜細(xì)胞干細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生，然而因受多種因素限制，神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成功率不

3、高，且移植后在宿主體內(nèi)的存活率尚低，因此，基因工程神經(jīng)干細(xì)胞就成為了神經(jīng)干細(xì)胞的主要來源。動物和臨床研究實驗均已證實用定向分化的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦損傷、帕金森氏病、脫髓鞘疾病、老年性癡呆、腦梗塞以及惡性腦腫瘤、脊髓損傷、癲癇等起到了良好療效，為使用常規(guī)方法難以見效的神經(jīng)疾患治療提供了廣闊的思路和誘人的前景。新生動物腦組織內(nèi)存在神經(jīng)干細(xì)胞，如何使這些神經(jīng)干細(xì)胞移植后到達(dá)治療區(qū)，并定向分化為目的神經(jīng)細(xì)胞一直是科學(xué)家們致力研究的熱點。已有研

4、究證明，神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化受多種因素的制約，包括基因、轉(zhuǎn)錄因子以及神經(jīng)干細(xì)胞所處的局部微環(huán)境，F(xiàn)oxgl基因便是這諸多因素之一。大量研究表明新生動物HIBD后腦結(jié)構(gòu)與功能重建是胚胎期發(fā)育的再現(xiàn)和延續(xù)，F(xiàn)oxgl基因在大腦發(fā)育過程中扮演著重要角色。Foxgl基因是目前已知的調(diào)控大腦結(jié)構(gòu)發(fā)育的關(guān)鍵基因，其缺失將導(dǎo)致整個大腦半球發(fā)育不良。Foxgl基因在生后仍可持續(xù)表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞聚集區(qū)的室管膜下區(qū)及海馬等部位，在神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化過程中

5、發(fā)揮著重要作用。然而Foxgl調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的機(jī)制是什么?在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮著怎樣的作用，目前的研究尚無明確回答。國外的研究表明，F(xiàn)oxgl調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖可能與抑制p21基因的表達(dá)有關(guān)。本實驗通過臍血源性神經(jīng)干細(xì)胞移植，觀察HIBD后新生大鼠腦組織海馬區(qū)(subgranularzone，SGZ)Foxgl與p21基因mRNA表達(dá)的變化，探討NSCs移植對二者的影響。為基因工程神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

6、　　 目的：
　　 本實驗旨在通過分離和培養(yǎng)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)其向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化，通過尾靜脈途徑移植入HIBD新生大鼠體內(nèi)，采用原位雜交法，分別于各時間點測定HIBD及NSCs移植后SGZ區(qū)Foxgl基因與p21基因mRNA表達(dá)的變化水平，記錄二者變化趨勢，探討HIBD及NSCs移植后海馬區(qū)二者表達(dá)變化的關(guān)系，從基因水平進(jìn)一步探討神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控機(jī)制，對提高NSCs移植后在腦組織受損部位增殖與分化效率具有

7、重要意義，為基因工程神經(jīng)干細(xì)胞在臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 收集健康足月產(chǎn)婦胎盤臍帶血，分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，采用細(xì)胞培養(yǎng)法，培養(yǎng)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，并定向誘導(dǎo)分化，利用免疫細(xì)咆化學(xué)法鑒定。以7日齡SD新生大鼠為研究對象，共150只，雌雄不限。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其隨機(jī)分為HIBD-NSCs移植組，HIBD組，假手術(shù)組，各組分別50只。采用經(jīng)典Rice法制作HIBD模型，模型制作后1d將培養(yǎng)的NSCs移

8、植入HIBD大鼠體內(nèi)，設(shè)模型制作成功后3d、7d、14d、21d、28d為觀察點。分別于各觀察點將大鼠處死，取右側(cè)半球腦組織，10％甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋固定，HE染色鑒定模型，以原位雜交法，測定各時間點FoxglmRNA與p21mRNA在海馬區(qū)的表達(dá)變化，觀察神經(jīng)干細(xì)胞移植對二者表達(dá)的影響，探索二者的內(nèi)在聯(lián)系。
　　 結(jié)果：
　　 1原代培養(yǎng)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 培養(yǎng)的原代MSCs呈圓形，7天后

9、呈短梭形，單個核，折光性較強(qiáng)，后逐漸伸出突起，期間混有破骨樣細(xì)胞，體積較大，呈圓形，多個核。28天左右細(xì)胞鋪滿瓶底。
　　 2臍血源性神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定
　　 原代細(xì)胞鋪滿瓶底80％時，加入誘導(dǎo)劑hEGF，bFGF，誘導(dǎo)其向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化。免疫細(xì)胞化學(xué)染色，觀察Nestin、NSE、GFAP陽性細(xì)胞數(shù)在誘導(dǎo)后表達(dá)較誘導(dǎo)前明顯增加。
　　 3 HIBD動物模型鑒定
　　 常規(guī)HE染色檢查結(jié)果示：左側(cè)

10、（結(jié)扎側(cè)）出現(xiàn)顯著的病理變化，SGZ區(qū)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元壞死。
　　 4原位雜交檢測結(jié)果：
　　 (1)Foxgl基因mRNA在假手術(shù)組SGZ區(qū)有表達(dá)，在HIBD組和HIBD-NSCs移植組，于模型制作后第7天表達(dá)最高，此后逐漸下降。
　　 (2)p21基因mRNA在假手術(shù)組SGZ區(qū)有表達(dá)，在HIBD組和HIBD-NSCs移植組，于模型制作后第7天表達(dá)最低，此后逐漸上升。
　　 5統(tǒng)計學(xué)結(jié)果
　　

11、Foxgl基因mRNA與p21基因mRNA的表達(dá)在HIBD組、HIBD-NSCs移植組及假手術(shù)組均呈負(fù)相關(guān)；在HIBD組，其二者的相關(guān)系數(shù)r值為-0.743；在假手術(shù)組，二者的相關(guān)系數(shù)為-0.891(P＜0.05)，在HIBD-NSCs移植組，二者的相關(guān)系數(shù)為-0.841。
　　 結(jié)論：
　　 1 Foxgl基因出生后仍可表達(dá)于腦組織SGZ區(qū)。HIBD可改變體內(nèi)微環(huán)境從而使FoxglmRNA表達(dá)上升，促進(jìn)腦組織損傷后的結(jié)