家豬骨髓基質(zhì)細(xì)胞的多向分化與透明質(zhì)酸成骨作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、長期以來，自體骨移植一直是骨的修復(fù)與重建方法的金標(biāo)準(zhǔn)。由于自體骨移植存在許多不足，如取材有限、失血、延長手術(shù)時(shí)間、疤痕形成、增加病人痛苦等，因此，尋找安全有效的替代自體骨移植的方法成為世界性研究熱點(diǎn)。近年來，隨著材料科學(xué)的進(jìn)展，骨組織工程技術(shù)得到了迅速發(fā)展。然而，基于支架材料的骨組織工程技術(shù)所遇到的一些基本問題尚未完全解決，阻礙了該技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用。這些基本問題包括：種子細(xì)胞的來源、種子細(xì)胞的擴(kuò)增與分化調(diào)控、以及支架材料的選擇等問

2、題。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)是骨髓中的一類非造血干細(xì)胞，它不僅具有支持和調(diào)節(jié)骨髓造血的功能，而且在適宜的條件下可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等分化，并且能在體外自我更新，成為理想的組織工程種子細(xì)胞。 迄今為止，已從人、大鼠、小鼠、雞、牛、狗、豬等骨髓中分離出BMSC。自從Friedenstein等(1976)首次利用貼塑料壁的特點(diǎn)從成體骨髓中分離出具有成骨潛能的BMSC以來，人們對其分化特性及其機(jī)制進(jìn)行了大量的研究。

3、BMSC分化調(diào)控通路受多種細(xì)胞因子、激素、物理作用等復(fù)雜因素的影響。這些因素在轉(zhuǎn)錄因子水平通過調(diào)控各自分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，從而最終決定細(xì)胞分化方向。骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的一般特點(diǎn)是成骨細(xì)胞形態(tài)的形成、堿性磷酸酶(ALP)活性的增加以及包含I型膠原(C011)、骨涎蛋白(BSP)、骨連接素(ON)和骨鈣素(OC)等骨基質(zhì)蛋白的骨樣礦化形成。核心結(jié)合因子a1(cbfal)和位于cbfal的下游的osterix被認(rèn)為是骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的

4、最關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。 目前，以家豬BMSC作為組織工程種子細(xì)胞的研究日益增多，家豬BMSC被認(rèn)為是較為理想的組織工程種子細(xì)胞模型，但其多向分化研究報(bào)道不多。在體外誘導(dǎo)其BMSC的成骨、成軟骨和成脂肪分化，調(diào)查其各向分化相關(guān)基因的表達(dá)及其相互關(guān)系將為進(jìn)一步以家豬BMSC作為細(xì)胞模型進(jìn)行組織工程的相關(guān)基礎(chǔ)研究打下基礎(chǔ)。 另一方面，在構(gòu)建組織工程骨時(shí)，支架材料對于骨與關(guān)節(jié)組織修復(fù)與重建十分重要。三維多孔金屬鉭支架材料由于良好的機(jī)械

5、強(qiáng)度以及多孔的特點(diǎn)，在臨床上用作非骨水泥型人工關(guān)節(jié)的骨接觸面已有10余年的歷史，近年來也用于制作脊柱融合器。然而，與其它多孔材料一樣，單純將多孔金屬鉭植入病人體內(nèi)，僅通過周圍組織的長入來達(dá)到生物學(xué)固定，難以實(shí)現(xiàn)有目的、可控制的組織再生，達(dá)不到與周圍骨組織愈合的預(yù)期效果。因此，需要同時(shí)在支架材料內(nèi)或者周圍結(jié)合自體骨、異體骨、生長因子或具有多分化潛能的BMSC，發(fā)揮支架材料的骨傳導(dǎo)作用與其他生物學(xué)因子的骨誘導(dǎo)作用，從而達(dá)到骨的修復(fù)重建的目的

6、。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床研究報(bào)道了多種生物材料復(fù)合重組人類骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)在脊柱融合方面成功的結(jié)果。但rhBMP-2價(jià)格昂貴，臨床上難以廣泛推廣。牛Ⅰ型膠原蛋白和羥基磷灰石／磷酸三鈣的復(fù)合物(Collagraft)作為組織工程骨支架材料有較大的潛力，但這種類型材料缺乏機(jī)械強(qiáng)度，其臨床應(yīng)用受到一定的限制。 透明質(zhì)酸(HA)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重要的組成成分，廣泛分布于機(jī)體各種組織之中，在長骨，它占總粘多糖(GAG)的

7、3％。它不僅是結(jié)構(gòu)成分，而且通過結(jié)合細(xì)胞表面受體，在生理和病理修復(fù)過程中參與細(xì)胞的遷移、增殖、聚集和分化。最近研究報(bào)道，低分子量透明質(zhì)酸能促進(jìn)小鼠顱骨成骨細(xì)胞的體外成骨。高分子量透明質(zhì)酸能加速小鼠骨創(chuàng)面的愈合。高分子量透明質(zhì)酸處理大鼠顱骨成骨細(xì)胞48小時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性的表達(dá)及上調(diào)骨鈣素。透明質(zhì)酸可明顯刺激家豬BMSC增殖，早期誘導(dǎo)堿性磷酸酶分泌及上調(diào)骨鈣素基因表達(dá)水平。 本論文以家豬BMSC為研究對象，

8、著重探討其體外多向分化機(jī)制和透明質(zhì)酸對其成骨分化的影響；以家豬前路椎體間融合模型為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，建立術(shù)中分離BMSC技術(shù)，將BMSC與透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合接種于多孔金屬鉭脊柱融合器后，立即植入家豬椎體間隙。在骨環(huán)境中，利用透明質(zhì)酸對BMSC體內(nèi)擴(kuò)增與成骨分化作用，促進(jìn)脊柱融合的愈合。并與Collagraft復(fù)合BMSC或rhBMP-2相比較，以期發(fā)展是一種新穎的、經(jīng)濟(jì)的、簡單易行的、有效的自體骨替代物。論文共分3部分： 第一部分

9、 家豬骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨、成軟骨與成脂肪分化相關(guān)基因表達(dá)的分析 1方法 1.1 BMSC分離 1.2 BMSC分化 1、3數(shù)據(jù)處理數(shù) 2結(jié)果 2．1家豬BMSC特征 培養(yǎng)第1天，有核細(xì)胞大部分由懸浮的圓形血源性細(xì)胞組成。第3天換液棄除這些非貼壁細(xì)胞，BMSC克隆開始形成，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長。第7天，在顯微鏡下觀察到大小不一的克隆。BMSC占有核細(xì)胞的0.002-0.01

10、％。細(xì)胞在12到14天基本長滿。我們觀察到細(xì)胞傳代到10代仍保持成纖維細(xì)胞樣生長和增殖能力。原代細(xì)胞群體倍增值(PDs)平均為13，傳代倍增次數(shù)平均為2.8。 2．2家豬BMSC成骨分化 2．2．1 BMSC形態(tài)學(xué)與組織學(xué)觀察 2．2．3BMSC成骨分化相關(guān)基因的表達(dá) 2．3 BMSC成脂肪分化 2．4 BMSC成軟骨分化 3 結(jié)論 3．1密度梯度離心法從骨髓分離的家豬BMSC

11、具有多向分化潛能，體外能向成骨、成脂肪和成軟骨分化。 3．2家豬BMSC向某個(gè)方向分化的潛能有賴于該向分化特異基因的上調(diào)和其它方向分化基因的抑制。 第二部分 透明質(zhì)酸對家豬骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外成骨分化的影響 1方法 1.1 BMSC的分離 方法同第一部分所述。 1.2 BMSC培養(yǎng) 第一代細(xì)胞長滿消化后，6000 cells/cm<'2>的BMSC分別種植在普通培養(yǎng)液和含4.0 mg

12、/ml 800 kDa透明質(zhì)酸的普通培養(yǎng)液中，培養(yǎng)7天。之后，經(jīng)透明質(zhì)酸預(yù)處理的BMSC消化后，分別種植在普通培養(yǎng)液、含透明質(zhì)酸的普通培養(yǎng)液、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液和含透明質(zhì)酸的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。未經(jīng)透明質(zhì)酸預(yù)處理的BMSC分別種植在普通培養(yǎng)液和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。分別在第7、14、21天收集細(xì)胞，進(jìn)行基因表達(dá)分析，于第21天進(jìn)行鈣沉積檢測。 1.3.透明質(zhì)酸對BMSC增殖的影響 1000cells/cm<'2>的BMSC

13、分別種植在上述培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天。SYBR green I檢測細(xì)胞數(shù)。 1.4.數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 10.0(Chicago，IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞增殖和鈣沉積用單因素方差分析(One-way ANOVA)?；虮磉_(dá)結(jié)果用兩因素方差分析(Two-way ANOVA)，當(dāng)各因素的主效應(yīng)或主效應(yīng)之間的交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)意義時(shí)，采用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

14、 2結(jié)果 2.1透明質(zhì)酸對BMSC增殖的影響 2.2透明質(zhì)酸對BMSC礦化的影響 2.3透明質(zhì)酸對細(xì)胞內(nèi)透明質(zhì)酸合成酶2(has2)的影響 2.4透明質(zhì)酸對BMSC成骨相關(guān)基因基礎(chǔ)表達(dá)水平的影響 2.5透明質(zhì)酸對BMSC成骨相關(guān)基因表達(dá)與作用時(shí)間的關(guān)系 3結(jié)論 透明質(zhì)酸對BMSC成骨分化的早期和后期均有重要作用。在早期，透明質(zhì)酸主要促進(jìn)BMSC增殖；在中晚期，

15、在成骨條件下，透明質(zhì)酸可增強(qiáng)BMSC成骨分化。 第三部分 透明質(zhì)酸復(fù)合自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞在家豬脊柱融合模型中的作用 1方法 1.1骨髓的抽取和分離 術(shù)前脛骨近端抽取骨髓，F(xiàn)icoll-Paque Plus分離，細(xì)胞記數(shù)，具體方法同 第一部分所述。 1．2多孔金屬鉭椎間融合器和圓盤的準(zhǔn)備 1.3細(xì)胞、透明質(zhì)酸與多孔金屬鉭圓盤的體外培養(yǎng) 1.4數(shù)據(jù)處理 2結(jié)

16、果 2.1細(xì)胞、透明質(zhì)酸與多孔金屬鉭圓盤的體外培養(yǎng)結(jié)果 體外培養(yǎng)24小時(shí)和7天的細(xì)胞數(shù)分另lJ為98955.3±14456.3和92462.8±17456.0，兩者無顯著差異(P~-0.05)?；睿兰?xì)胞染色結(jié)果證實(shí)，活細(xì)胞不僅存在于24小時(shí)培養(yǎng)的多孔鉭圓盤表面，而且存在于7天培養(yǎng)的多孔鉭圓盤內(nèi)部。 2.2組織學(xué)觀察 組織學(xué)觀察表明：與Collagraft復(fù)合BMSC或rhBMP-2組兩個(gè)對

17、照組相比較，透明質(zhì)酸復(fù)合BMSC在多孔金屬鉭融合器中央孔中形成的小梁骨形態(tài)學(xué)上更為成熟，Collagrat~組仍殘留有羥基磷灰石／磷酸三鈣。多孔金屬鉭材料小孔內(nèi)以及椎體相鄰區(qū)域的骨組織沒有明顯區(qū)別。 2.3骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測結(jié)果 在透明質(zhì)酸復(fù)合細(xì)胞組、Collagratt復(fù)合細(xì)胞或rhBMP-2組中，多孔金屬鉭材料小孔中，所形成的新骨骨量分別為19.8％、1 8.5％、20.2％。在上述各組多孔金屬鉭脊柱融合器的中央