復方殼多糖組織工程皮膚基底膜重建的實驗研究.pdf

1、皮膚基底膜是位于表皮與真皮之間的一條厚約0.5～1.0μm的重要結構，具有許多重要生物學功能，最明顯的功能是緊密連接表皮與真皮，為表皮和真皮提供有力的結合力，避免生理條件下表皮的分離；另一個顯著作用是確定表皮細胞的極性，提供表皮移行的屏障。在正常環(huán)境中，基底膜可抑制表皮細胞與真皮的直接接觸。此外，還具有滲透和屏障等作用，在保持皮膚的完整性中起著不可替代的作用。 皮膚基底膜主要由Ⅳ型和Ⅶ型膠原、LN(LN-5、6和10)、巢蛋白和

2、基底膜蛋白多糖等多種成分組成。Ⅳ型膠原和LN是基底膜的兩個主要組成成分，Ⅳ型膠原形成一級網絡結構，提供顯著的機械穩(wěn)定性，LN結合到Ⅳ型膠原與巢蛋白等相互作用形成二級網絡。在超微結構上，基底膜可大致分為三層，即透明板、致密板和纖維網層。透明板是位于致密板和形成高電子密度斑塊即半橋粒的基底層細胞之間的區(qū)域。錨絲主要由LN-5聚集于透明板形成，與皮膚的半橋粒相對應。致密板主要由Ⅳ型膠原、LN和基底膜蛋白多糖組成的層狀結構。纖維網層位于致密板下

3、，含有原纖維，位于表真皮連接的主要由Ⅶ型膠原組成的錨原纖維。 表真皮易于分離是目前雙層組織工程皮膚的重要缺陷，其根本原因就是因為表真皮間沒有構建完整的基底膜。即使形成了基底膜，其結構也不連續(xù)，表真皮結合能力不能適應操作需要。表真皮細胞的相互作用可以促進基底膜的成分蛋白如Ⅳ型、Ⅶ型膠原、巢蛋白、LN等大分子的合成，并形成多層次網絡結構，共同維持表真皮連接的穩(wěn)定性。 皮膚替代物中致密層形成的形態(tài)學順序如下： (1)沿

4、著基底細胞內側出現半橋粒結構； (2)局部出現與半橋粒以錨絲相連的致密板； (3)致密層側向延長。其中，半橋粒結構可能會作為皮膚替代物的核心來促進基底膜的形成，并且半橋粒結構因加入LN-5而獲得的增加量可以加速皮膚替代物的基底膜裝配。 LN-5是一種促進KC粘附非常有效的物質。LN-5定位于跨越透明板的錨絲。在體內，LN-5被證實是在真表皮連接中橋聯基底層細胞和致密板的錨絲的的主要組成成分。目前已有學者利用在培養(yǎng)

5、系統(tǒng)中加入外源性LN-5，促進表真皮間基底膜的形成，結果發(fā)現，在皮膚替代物中加入外源性LN-5的作用，可以促進致密板的形成，并呈濃度依賴性。 本實驗利用復方殼多糖組織工程皮膚技術平臺，通過調節(jié)培養(yǎng)基的鈣濃度影響KC與FB的相互作用，促進基底膜的形成；不同時相加入不同濃度的外源性LN，觀察基底膜形成情況；首次將力學環(huán)境引入組織工程皮膚研究，模擬在體力學環(huán)境，對培養(yǎng)的組織工程皮膚進行垂直應力作用，觀察種子細胞生物學行為改變后基底膜形

6、成的情況；采用H.E.染色、PAS染色、Ⅳ型膠原、Ⅶ型膠原、CK14、LN等免疫組化染色、電鏡等方法，觀察基底膜構建情況；在此基礎上，采用免疫印跡蛋白表達分析，測定陳舊培養(yǎng)基中游離LN-5的含量情況，探討LN-5在構建組織工程皮膚基底膜中的作用；建立平板流動腔模型，對重建了基底膜的組織工程皮膚進行流體剪切力的作用，觀察組織工程皮膚對剪切應力的耐受情況，初步評價組織工程皮膚的物理性能；將組織工程皮膚移植于動物全層創(chuàng)面，觀察移植物覆蓋創(chuàng)面情

7、況。 本實驗獲得如下主要研究結果： (1)通過調節(jié)培養(yǎng)基鈣濃度和加入外源性LN，成功構建結構良好的基底膜，發(fā)現高鈣環(huán)境和在培養(yǎng)7天后加LN更有助于基底膜的形成，加入高濃度的LN形成的基底膜要明顯優(yōu)于低濃度組； (2)首次建立組織工程皮膚的垂直應力作用模型，通過不同的應力作用，發(fā)現每天1次，持續(xù)15～30min的垂直應力作用，有助于基底膜體外重建； (3)構建了基底膜的組織工程皮膚，其表真皮間Ⅳ型膠原、Ⅶ型

8、膠原及LN的免疫組化反應陽性，表皮下部分CK14染色呈陽性反應； (4)電鏡下可見表真皮間有數目不等的半橋粒形成，尤以垂直應力作用后的組織工程皮膚明顯； (5)陳舊培養(yǎng)基中游離LN-5的測定，結果提示垂直應力作用可促進KC分泌LN-5，低鈣環(huán)境有利于KC增殖并合成LN-5，加入外源性LN可有效提高游離LN-5的濃度； (6)構建了基底膜的組織工程皮膚，可以抵抗一定的剪切應力，尤以經過垂直應力作用的組織工程皮膚為佳

9、；(7)組織工程皮膚可有效修復動物全層皮膚缺損創(chuàng)面。 本研究通過在培養(yǎng)系統(tǒng)中調節(jié)鈣濃度，添加外源性LN，成功地構建了基底膜結構，利用H.E.染色、PAS染色、免疫組化、電鏡等技術，評價基底膜的組織學結構及重建水平；對LN在組織工程皮膚基底膜重建中的中心作用進行了有益的探索，明確了LN在基底膜分子網絡形成中的重要地位；模擬在體毛細血管壓力的力學環(huán)境，觀察了垂直應力作用對基底膜形成的影響，發(fā)現給予垂直應力有利于基底膜的重建，并在增加

10、半橋粒的數目上有明顯作用；利用平板流動腔模型，對獲得的重建了基底膜的組織工程皮膚進行初步的力學評價。 本實驗結果提示，進行組織工程皮膚器官型培養(yǎng)，培養(yǎng)基鈣濃度以1.95mM為宜，LN添加以20μg/ml為宜，且加入的最佳時間是在培養(yǎng)7天后，組織工程皮膚分層分化最好的時間在培養(yǎng)15天左右。本研究首次提出了優(yōu)化培養(yǎng)條件的方案，證實了LN-5在重建基底膜中的中心作用；首次在組織工程皮膚研究中引入力學因素，證實了力學環(huán)境因素對體外構建基