pGC-FU-存活素慢病毒表達質粒的構建.pdf

1、背景及目的：
　　 我國是乙型病毒性肝炎高發(fā)地區(qū)，人群HBV攜帶率尤其較高，最終發(fā)展到乙型肝炎肝衰竭幾率較大。乙型肝炎肝衰竭多是在慢性乙肝病毒感染的過程中短期內出現(xiàn)的大量肝細胞壞死，肝功能衰竭。因其病情發(fā)展迅速，病死率高，目前對該病尚無有效內科治療。肝移植是治療的最終方案，而目前我國面臨嚴重的供體短缺和移植價格高昂等問題。因此，乙型肝炎肝衰竭因嚴重影響人民的身體健康而一直受到臨床醫(yī)生和研究者重視。目前肝細胞移植一直是研究熱點，各

2、國學者通過不同途徑試圖探究能用于治療性移植的肝細胞。與其他途徑的細胞學治療相比較，經基因學改造的原代肝細胞具有遺傳背景和生物學功能與正常肝細胞最相似，且惡變幾率較小，遺傳性狀易于保持等優(yōu)點。但原代肝細胞存在培養(yǎng)困難，壽命短，難以傳代，轉染率極低等局限性，所以，基因經慢病毒介導感染細胞，實現(xiàn)穩(wěn)定轉染十分必要。
　　 存活素(survivin)是目前發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，目前現(xiàn)有研究均提示survivin與細胞增殖和細胞周期調控存

3、在一定關系。對此，我們選擇構建pGC-FU-survivin慢病毒質粒，以期在下步實驗中利用survivin蛋白的表達影響原代肝細胞的增殖。
　　 方法：
　　 1.從高表達survivin的小鼠淋巴瘤細胞株YAC-I中獲取存活素(survivin)基因，連接到pcDNA3.1(+)質粒上，雙酶切及雙向測序鑒定。
　　 2.構建pGC-FU-survivin 慢病毒載體,從基因水平和蛋白質水平鑒定含有surviv

4、in的目的片段表達。經包裝，純化，獲得滴度較高的病毒顆粒進行下一步生物學功能研究。3.將病毒感染小鼠原代肝細胞
　　 結果：1.雙酶切及測序證實從YAC-I中獲得的survivin基因連接到pcDNA3.1(+)質粒上，除第317位堿基由腺苷酸突變?yōu)樾叵汆奏ね?，其余都與NCBI基因文庫中survivin基因切合，該突變不影響蛋白質空間結構及蛋白質生理功能。
　　 2.構建好的pGC-FU-survivin表達質粒的陽性克

5、隆菌株轉染293T 細胞后熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光，Western-Blotting結果見一與標準品大小相同的條帶。在293T 細胞中進行病毒包裝，最終純化出pGC-FU-survivin慢病毒顆粒。
　　 3.pGC-FU-survivin 質?？沙晒Ω腥拘∈笤渭毎蚋腥韭嗜晕催_到滿意要求，目前仍在改進。
　　 結論：
　　 借助T載體及pcDNA3.1(+)質粒，成功在pGC-FU慢病毒表達質粒上