通用真菌引物和探針檢測人全血標(biāo)本中侵襲性真菌DNA載量的方法.pdf

1、長期腸外營養(yǎng)支持的外科危重患者可出現(xiàn)腸黏膜屏障損傷及腸道微生物移位入血引起全身感染及發(fā)熱，不恰當(dāng)?shù)目股貞?yīng)用不但無療效且會進(jìn)一步損傷腸粘膜屏障;因此有必要建立快速鑒別血中細(xì)菌及真菌等各類微生物的方法。本研究旨在建立實時定量PCR(RQ-PCR)以真菌通用引物和探針快速準(zhǔn)確檢測人全血標(biāo)本中侵襲性真菌DNA載量的方法并與細(xì)菌相鑒別及進(jìn)行初步臨床應(yīng)用。
　　 在論文中，選擇臨床常見基因組多拷貝基因5.8S rDNA作為靶基因設(shè)計特異性

2、引物和TaqMan探針，采用QIAamp(R)DNA Blood Mini Kit提取多種致病真菌基因組DNA，建立20μl RQ-PCR反應(yīng)體系，對含有不同載量致病真菌的模擬人全血標(biāo)本和71份外科發(fā)熱患者全血標(biāo)本進(jìn)行侵襲性真菌基因組的定量檢測。結(jié)果顯示本方法的特異性良好，檢測限為1.0×101 copies/μl上機待測的擴(kuò)增反應(yīng)液（即約1.0×105 copies/ml全血）;檢測靈敏度和特異度分別為95.5％和97.6％，陽性預(yù)告

3、值和陰性預(yù)告值分別為98.7％和92.0％;標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.9931～0.9977之間;批內(nèi)及批間平均重復(fù)性變異系數(shù)(CV)分別為(10.4±4.0)％和（27.9±2.0）％;人血標(biāo)本中真菌基因組DNA平均回收率為(91.0±7.6％)，相對回收率平均變異系數(shù)為（14.9±4.0）％。71份外科發(fā)熱患者血標(biāo)本中未檢測出侵襲性真菌基因組。RQ-PCR可以借通用真菌引物和TaqMan探針快速、特異、靈敏地定量檢測人血標(biāo)本中侵襲性真菌DN