UCP2在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)與缺氧關(guān)系的探討.pdf

1、目的與背景
　　解耦聯(lián)蛋白2（uncouplingprotein2，UCP2）屬于線粒體離子轉(zhuǎn)移蛋白，定位于線粒體內(nèi)膜上。其廣泛低表達(dá)于各種正常組織，但在病理狀態(tài)下高表達(dá)。UCP2在體內(nèi)可抑制腫瘤生長(zhǎng),但在腫瘤組織中可以保護(hù)腫瘤對(duì)抗放、化療的作用。目前，UCP2在體內(nèi)被激活途徑尚不清楚。缺氧是腫瘤中常見(jiàn)的微環(huán)境，在缺氧下UCP2的作用及通路亦不明確。本研究探討了UCP2在非小細(xì)胞肺癌中與缺氧的關(guān)系，UCP2在體內(nèi)激活的途徑，為腫瘤

2、的發(fā)生及治療的新思路作了探索。
　　材料與方法
　　1．收集83例I-Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌病人切除標(biāo)本，取正常肺組織、癌組織。按性別、年齡、病理類(lèi)型、及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，分析UCP2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床特點(diǎn)的相關(guān)性。以及UCP2與HIF-1a表達(dá)關(guān)系。
　　2．探討UCP2在腫瘤細(xì)胞內(nèi)激活途徑：體外使用100uM，150uM，200uMCOCl2誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞缺氧。用Real-timePCR及Westernb

3、lot分析UCP2不同缺氧條件下RNA表達(dá)及蛋白水平。
　　3．體外構(gòu)建PCDNA3.1-UCP2質(zhì)粒及SiRNA-UCP2小干擾RNA，轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞系，用Real-timePCR及Westernblot分析、確定其上調(diào)還是抑制A549細(xì)胞中UCP2的表達(dá)，建立UCP2過(guò)表達(dá)或UCP2沉默的A549細(xì)胞。
　　4．探討UCP2在腫瘤細(xì)胞缺氧中的作用：1）流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞在不同缺氧條件下細(xì)胞凋亡情況，確定本

4、實(shí)驗(yàn)最適缺氧條件。2）在最適的缺氧條件下通過(guò)調(diào)控UCP2的表達(dá)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況，探討UCP2在腫瘤細(xì)胞缺氧條件下與凋亡的關(guān)系。3）檢測(cè)ROS、細(xì)胞色素C、Caspase-9，研究UCP2細(xì)胞缺氧凋亡通路。
　　研究結(jié)果
　　1．免疫組化分析83例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本顯示：瘤組織中UCP2的表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿中，呈黃色至棕黃色染色，表達(dá)率為：72.3％。在正常肺組織中，中未檢測(cè)到UCP2。為了解UCP2表達(dá)與臨

5、床特點(diǎn)的關(guān)系，按年齡、性別、病理分型、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組分析結(jié)果顯示：UCP2的表達(dá)與年齡（P=0.28）、性別（P=0.19）無(wú)關(guān)；鱗、腺癌間具有顯著差異（p=0.001）；同時(shí)，UCP2的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P=0.010）。
　　2．連續(xù)切片HIF-1a免疫組化發(fā)現(xiàn)：UCP2的表達(dá)存在區(qū)域性，其陽(yáng)性區(qū)域與HIF-1a陽(yáng)性區(qū)域一致。二者在表達(dá)量上存在關(guān)聯(lián)性。但在4例HIF-1a陽(yáng)性標(biāo)本未能檢測(cè)到UCP2的表達(dá)。且在同一標(biāo)本

6、存在UCP2陽(yáng)性而HIF-1a陰性的現(xiàn)象。
　　3．A549細(xì)胞在不同濃度COCl2誘導(dǎo)下，檢測(cè)HIF-1amRNA及蛋白水平，證實(shí)COCl2可以誘導(dǎo)出缺氧。在不同缺氧條件下，UCP2和HIF-1a在mRNA及蛋白水平表達(dá)隨缺氧程度而增加，結(jié)果顯示：UCP2在缺氧中mRNA較蛋白水平增加明顯；但是，在同樣的缺氧條件下，HIF-1a表達(dá)量較UCP2的表達(dá)量增加明顯。
　　4．經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)

7、表明，PCDNA3.1-UCP2-A549較陰性對(duì)照細(xì)胞UCP2蛋白表達(dá)明顯增高。SiRNA-UCP2-A549較陰性對(duì)照細(xì)胞UCP2蛋白表達(dá)明顯下降。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明這兩種方法可以在A549中調(diào)控UCP2的表達(dá)。
　　5．流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：A549細(xì)胞凋亡數(shù)與缺氧程度呈正比。A549細(xì)胞在CoCl2濃度大于150uM誘導(dǎo)缺氧條件下與正常氧狀態(tài)相比，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(19.64±4.88VS12.2±5.88,P

8、<0.05）。我們選用150uMCoCl2作為以后缺氧實(shí)驗(yàn)的條件，在此條件下，過(guò)表達(dá)UCP2的A549細(xì)胞較陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡減少(6.96±1.05VS15.98±2.22,P<0.001）；沉默UCP2的A549細(xì)胞較陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡明顯增多(24.3±1.55VS12.76±1.37,P<0.001）。提示UCP2可以抑制腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下凋亡。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，在沉默UCP2細(xì)胞內(nèi)，ROS的量比陰性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS的量明

9、顯增加(60.3±4.18VS51.11±2.22,P=0.006)。相反，過(guò)表達(dá)UCP2的細(xì)胞內(nèi)ROS量比陰性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS量明顯減少(42.16±2.78VS52.92±2.63,P<0.001)。Westernblotting結(jié)果顯示：沉默UCP2蛋白的A549細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C及Caspase蛋白條帶較空白對(duì)照細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C及Caspase蛋白條帶增強(qiáng)。然而，UCP2過(guò)表達(dá)時(shí)，A549細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C及Caspa

10、se蛋白條帶較空白對(duì)照細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C及Caspase蛋白條帶減弱。
　　結(jié)論
　　1．通過(guò)免疫組化法檢測(cè)，UCP2的表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿中，呈黃色至棕黃色染色。UCP2在非小細(xì)胞癌中表達(dá)的臨床特點(diǎn)：癌組織中高于正常肺組織；其表達(dá)量與年齡、性別無(wú)關(guān)，但與腫瘤類(lèi)型及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。UCP2有望成為判斷NSCLC轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指標(biāo)之一。
　　2．通過(guò)組織切片實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：UCP2陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域與HIF-1a陽(yáng)性表達(dá)

11、區(qū)域一致，提示：缺氧可能在人體內(nèi)激活UCP2的表達(dá)。
　　3．A549細(xì)胞中UCP2的表達(dá)量隨缺氧程度而增加。提示：缺氧導(dǎo)致UCP2的表達(dá)增加。
　　4．A549細(xì)胞凋亡數(shù)與缺氧程度呈正比，體外通過(guò)COCl2誘導(dǎo)A549缺氧最宜缺氧條件為150mMCOCl2培養(yǎng)24h。
　　5．通過(guò)PCDNA3.1-UCP2質(zhì)粒及SiRNA-UCP2小干擾RNA可以在調(diào)控A549細(xì)胞中UCP2的表達(dá)。
　　6．腫瘤細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)U