Brd2基因的探針制備及其在小鼠大腦皮層的形態(tài)學研究.pdf

1、目的：為了觀察溴結構域包含蛋白2（Bromodomain containing protein2，Brd2）基因在小鼠大腦皮層的表達分布并系統(tǒng)了解其神經化學特點，本研究首先制備兩條地高辛標記的Brd2 cRNA反義探針。并且應用熒光原位雜交技術驗證兩條探針的檢測效果，之后選用其中一條探針觀察和分析Brd2 mRNA在C57BL/6小鼠大腦皮層組織的表達與神經化學特點。
　　方法：本實驗首先提取小鼠大腦皮層組織總RNA，設計兩對Br

2、d2引物，通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）方法，得到兩個Brd2基因的目的DNA片段，并將其分別克隆到pCRⅡ-TOPO載體中，根據載體上T7和SP6啟動子位點進行體外轉錄合成兩條地高辛標記的cRNA反義探針，應用熒光原位雜交實驗驗證兩條探針的特異性并觀察其在腦組織切片中的雜交效果。本實驗將12只健康成年C57BL/6小鼠隨機分為兩組，第一組小鼠灌注取材切片，應用熒光原位雜交實驗檢測Brd2基因在小鼠大腦皮層組織中的表達特點；第

3、二組小鼠腦組織切片則采用熒光原位雜交結合免疫熒光雙標染色的方法觀察與分析小鼠大腦皮層組織中Brd2 mRNA陽性細胞的神經化學特點。
　　結果：（1）本研究應用分子神經生物學技術成功構建了兩個Brd2/pCRⅡ-TOPO質粒，通過體外轉錄實驗獲得了兩條較高效價的地高辛標記的cRNA反義探針，在熒光原位雜交實驗中應用兩條探針顯示出較好的雜交效果。
　?。?）選擇兩條探針中的一條進行熒光原位雜交實驗，觀察和分析Brd2 mRN

4、A在C57BL/6小鼠大腦皮層組織中的表達情況。結果顯示在小鼠大腦皮層組織中，Brd2 mRNA存在不同強度的表達，而且主要表達于神經元所在的部位。
　　（3）采用熒光原位雜交結合免疫熒光雙重標記染色的方法觀察Brd2 mRNA陽性細胞與神經元核蛋白（NeuN），膠質纖維酸性蛋白（GFAP），γ-氨基丁酸（GABA），維生素D依賴性鈣結合蛋白（CB），鈣視網膜蛋白（CR）和小白蛋白（PV）在小鼠大腦皮層組織中的表達類型與共存情況。

5、結果顯示，C57BL/6小鼠大腦皮層組織中Brd2 mRNA陽性細胞主要表達分布于NeuN陽性的神經元中，而GFAP陽性的星形膠質細胞幾乎不表達Brd2 mRNA。在小鼠大腦皮層組織中，Brd2 mRNA與GABA、CB、CR和PV均有共存。其中Brd2/GABA共存細胞占Brd2 mRNA陽性細胞的18％，占GABA陽性細胞的52%；Brd2/CB共存細胞占Brd2 mRNA陽性細胞的23%，占CB陽性細胞的82%；Brd2/CR共存

6、細胞占Brd2 mRNA陽性細胞的20%，占CR陽性細胞的82%；Brd2/PV共存細胞占Brd2 mRNA陽性細胞的13%，占PV陽性細胞的31%。
　　結論：（1）本實驗制備的地高辛標記的cRNA反義探針可特異地檢測Brd2 mRNA在大腦皮層組織中的表達。
　　（2）Brd2 mRNA在C57BL/6小鼠大腦皮層組織中廣泛表達，并且主要表達于神經元中，星形膠質細胞幾乎不表達Brd2 mRNA。
　　（3）較系統(tǒng)地