ERβ基因衰老性甲基化對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞雌激素信號(hào)傳導(dǎo)通路的表觀遺傳學(xué)調(diào)控的研究.pdf

1、研究目的： 了解結(jié)腸癌細(xì)胞中雌激素信號(hào)傳導(dǎo)通路（Estrogen Signaling）的異常甲基化模式以及其與轉(zhuǎn)錄失活的因果關(guān)系，探討雌激素受體β亞型基因（Erβ）對(duì)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)通路的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式，從不同層次上深入研究Erβ基因衰老性甲基化的表觀遺傳學(xué)機(jī)制及其病理意義，了解Erβ基因甲基化在結(jié)腸癌早期診斷、預(yù)防、預(yù)后評(píng)估以及治療中的應(yīng)用價(jià)值，尤其是雌激素抑制結(jié)腸腫瘤發(fā)生的作用機(jī)制，探索將此抑制作用用于已發(fā)生的腫瘤的治療過(guò)

2、程的應(yīng)用價(jià)值和方法。 研究方法： 在整個(gè)一系列實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，作為預(yù)實(shí)驗(yàn)部分，首先采用甲基化特異性PCR（MSP）方法了解了結(jié)腸癌細(xì)胞株（HT-29，Caco-2和Lovo）中Erβ及其靶基因PR（含經(jīng)典的ERE元件）和c-fos原癌基因（含非經(jīng)典的AP-1結(jié)合位點(diǎn)）啟動(dòng)子CpG島的甲基化模式，采用常規(guī)PCR方法檢測(cè)了結(jié)腸癌細(xì)胞株中Erβ基因、hMLH1基因、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（Dnmt1）、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3a（Dnm

3、t3a）、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3b（Dnmt3b）以及組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(HMT)等表觀遺傳學(xué)酶譜的表達(dá)水平，為后續(xù)的研究打下基礎(chǔ)。 在此基礎(chǔ)上，采用針對(duì)Erβ基因的RNAi技術(shù)體外抑制Erβ基因的表達(dá)，觀察了Erβ基因轉(zhuǎn)錄失活對(duì)PR和c-fos基因啟動(dòng)子甲基化模式的調(diào)控以及表觀遺傳學(xué)酶譜表達(dá)的影響；同時(shí)，采用雌激素誘導(dǎo)或外源性Erβ基因?qū)氲炔煌侄?，正向調(diào)節(jié)Erβ基因表達(dá)，觀察Erβ基因表達(dá)恢復(fù)或激活對(duì)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)通路靶基因

4、啟動(dòng)子甲基化模式的調(diào)控以及表觀遺傳學(xué)酶譜表達(dá)的影響。通過(guò)對(duì)Erβ基因正反兩個(gè)方向的表達(dá)調(diào)節(jié)，觀察除了經(jīng)典的受體-配體結(jié)合方式外，Erβ基因是否還存在表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式或機(jī)制。 接下來(lái)的研究中，采用“甲基化特異性寡核苷酸技術(shù)”，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Erβ基因的特異性甲基化寡核苷酸片段，作用于原代培養(yǎng)的雌性乳鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中，以誘導(dǎo)Erβ基因啟動(dòng)子發(fā)生特異性甲基化而失活，從而體外構(gòu)建Erβ基因衰老性甲基化的結(jié)腸上皮細(xì)胞模型，以期模擬或者還

5、原Erβ基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表型和基因型，并在此基礎(chǔ)上觀察Erβ基因衰老性甲基化對(duì)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)通路的表觀遺傳學(xué)調(diào)控效應(yīng)，深入探討Erβ基因衰老性甲基化的表觀遺傳學(xué)機(jī)制及其病理意義，尤其是在雌激素預(yù)防女性結(jié)腸癌發(fā)生中可能的作用機(jī)理，為研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和早期診治結(jié)腸癌提供相關(guān)理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究結(jié)果： 雌激素信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因中，Erβ及其靶基因PR啟動(dòng)子CpG島在結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、Lovo和Cac

6、o-2中均呈現(xiàn)為典型的異常高甲基化模式；原癌基因c-fos啟動(dòng)子CpG島在三株結(jié)腸癌細(xì)胞中則表現(xiàn)為不完全性的部分甲基化。 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與內(nèi)參基因相比，ErβmRNA在三株結(jié)腸癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)為弱表達(dá)狀況。細(xì)胞爬片的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，Erβ蛋白主要定位在胞核，胞漿也有少量表達(dá)，其中在Caco-2中呈現(xiàn)中低度表達(dá)狀況，在Lovo和HT-29中則表現(xiàn)為弱表達(dá)。總的來(lái)說(shuō)，無(wú)論是ERβmRNA還是Erβ蛋白在三株癌細(xì)胞

7、株中的表達(dá)都是被抑制的。hMLH1基因mRNA在三株結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)顯著差異，均表現(xiàn)為中度表達(dá)水平。Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和HMT在結(jié)腸癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)不等的表達(dá)水平，Dnmt3a、Dnmt3b在分化良好的癌細(xì)胞中呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)狀況，而在分化不良或未分化的癌細(xì)胞中則被抑制表達(dá)。 針對(duì)Erβ基因設(shè)計(jì)的特異性小干擾RNA片段（siRNA）作用于Caco-2后，Erβ基因mRNA表達(dá)顯著下調(diào)；然而，Caco-2細(xì)胞中E

8、rβ，PR和c-fos等基因啟動(dòng)子甲基化模式在RNAi前后卻無(wú)任何改變；同時(shí)，對(duì)Dnmt1，Dnmt3a，Dnmt3b，HMT和hMLH1基因mRNA的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，RNAi作用前后這些基因的表達(dá)無(wú)顯著改變。 終濃度分別為10-6mol/L、10-8mol/L的雌二醇（E2）分別作用于Caco-2細(xì)胞兩周后，Erβ基因表達(dá)無(wú)明顯增高或其他改變。提示，單純應(yīng)用E2作用癌細(xì)胞可能并不能誘導(dǎo)Erβ的表達(dá)。接下來(lái)的研究采用常規(guī)基因重組技術(shù)

9、構(gòu)建Erβ真核表達(dá)載體并導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2。結(jié)果表明，外源性Erβ基因的導(dǎo)入可以顯著的激活雌激素信號(hào)傳導(dǎo)通路基因（PR、c-fos）的表達(dá)(P<0.01)，與此同時(shí)，該通路基因總體甲基化密度顯著降低。結(jié)合甲基化酶譜(Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b和HMT)表達(dá)水平的改變，本研究推測(cè)，這種調(diào)控作用很可能是通過(guò)去甲基化機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。不過(guò)，因?yàn)椴](méi)有完全逆轉(zhuǎn)原有的高甲基化模式，因此，Erβ對(duì)PR、c-fos的調(diào)控作用很可能是但

10、又不完全是通過(guò)去甲基化機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。換句話說(shuō)，結(jié)腸癌細(xì)胞中Erβ基因激活可以部分地逆轉(zhuǎn)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)通路基因的甲基化模式，使PR基因（含經(jīng)典的ERE元件）和c-fos原癌基因（含非經(jīng)典的AP-1結(jié)合位點(diǎn)）發(fā)生部分去甲基化并恢復(fù)近似正常的表達(dá)，在此過(guò)程中Erβ基因本身也發(fā)生了去甲基化改變。此外，Erβ基因?qū)隒aco-2后，hMLH1表達(dá)也明顯降低。Erβ與hMLH1之間是否存在以及存在何種相關(guān)性，尚有待進(jìn)一步研究。 本研究成功的

11、進(jìn)行了SD新生大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明，上皮細(xì)胞純度達(dá)95％以上。針對(duì)Erβ基因設(shè)計(jì)合成的特異性甲基化寡核苷酸（MO）片段成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入了結(jié)腸上皮細(xì)胞，并且在增殖比較旺盛的細(xì)胞團(tuán)塊中富集。MSP檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的MO片段成功誘導(dǎo)了Erβ基因啟動(dòng)子的特異性甲基化。結(jié)腸上皮細(xì)胞Erβ基因衰老性甲基化模型的建立，為從表觀遺傳學(xué)角度研究Erβ基因在結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制中的作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 深入研究發(fā)現(xiàn)

12、，Erβ基因發(fā)生衰老性甲基化而滅活的同時(shí)，下游的靶基因PR和c-fos的表達(dá)也顯著降低。對(duì)表觀遺傳學(xué)酶譜的檢測(cè)則表明，MO誘導(dǎo)前后從頭甲基化酶（Dnmt3a,Dnmt3b）和組蛋白甲基化酶（HMT）的表達(dá)也發(fā)生了顯著的改變，維持甲基化酶（Dnmt1）的表達(dá)卻無(wú)明顯變化。這表明，整個(gè)過(guò)程中發(fā)生了顯著的酶促條件下的從無(wú)到有的基因高甲基化和組蛋白高甲基化等表觀遺傳學(xué)基因型改變。結(jié)合正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中該通路非甲基化或低甲基化這一事實(shí)，就更容易理

13、解上述改變。 研究結(jié)論： 本研究結(jié)果提示，在結(jié)腸上皮細(xì)胞中，除了經(jīng)典的受體-配體結(jié)合方式外，Erβ基因還存在著表觀遺傳學(xué)作用方式和機(jī)制，作為結(jié)腸上皮細(xì)胞中的優(yōu)勢(shì)受體，Erβ基因的衰老性甲基化，對(duì)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)通路中相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化模式及正常的表達(dá)水平起著決定性作用：Erβ基因啟動(dòng)子衰老性甲基化→ Erβ基因表達(dá)滅活→表遺傳學(xué)酶譜活性發(fā)生改變，下游的PR，c-fos等基因啟動(dòng)子發(fā)生異常高甲基化→PR，c-fos等下游靶