急性髓系白血病初診患者組織蛋白酶B、L及血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達及意義.pdf

1、目的
　　 采用實時熒光定量RT-PCR的方法檢測CTSB、CTSL及VEGFmRNA的相對表達水平,分析三者在AML初診患者中及良性血液病患者中的表達變化及相關(guān)性。
　　 方法
　　 一、選取研究對象
　　 收集中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院血液病治療中心2009年1月-2011年1月住院及門診的AML患者41例,其中M11例,M210例,M310例,M49例,M59例,M62例,非惡性血液病患者25例做為對

2、照組。所有病例經(jīng)細胞形態(tài)學、細胞化學染色、流式細胞術(shù)免疫分型及PCR融合基因檢測確診為AML(FAB)。
　　 二、實時熒光定量PCR
　　 收集患者骨髓單個核細胞,提取總RNA,按試劑盒說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應體系合成cDNA,引物由Takara公司設計合成,采用SYBR Green I實時定量熒光PCR方法,以β-actin為內(nèi)參照,進行SYRB Green I實時熒光定量PCR,檢測CTSL、CTSB及VEGF的表達水

3、平。
　　 三、結(jié)果判斷
　　 將標準品cDNA10倍濃度梯度稀釋為5-6個濃度梯度,各取2μl作為模板進行Real Time PCR反應,由各擴增曲線得到的Ct值制作標準曲線,從而得到樣本的拷貝數(shù)。以β-actin作為內(nèi)參照,CTSL、CTSB及VEGF作為目的基因,通過目的基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比值進行樣本間相對定量的比較。
　　 四、統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包中Mann-Whi

4、tney檢驗,相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果
　　 一、方法的可靠性和準確性
　　 1、RNA的純度和質(zhì)量分析
　　 所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測,比值在1.8-2.0之間,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,條帶清晰可見,無明顯降解。
　　 2、擴增的特異性及定量的準確性
　　 標準品cDNA經(jīng)梯度稀釋后進行PCR反應,制作標準曲線。得到的標

5、準曲線相關(guān)系數(shù)(r2)均＞0.998,斜率在-3.3至-3.5之間,反映定量準確,擴增效率良好。擴增后溶解曲線顯示銳利的單一鋒,無其他非特異性鋒,說明擴增產(chǎn)物均一,無非特異擴增及引物二聚體。瓊脂糖凝膠電泳進一步驗證擴增片段的均一性及長度。
　　 二、CTSB、CTSL、VEGF的表達
　　 AML骨髓單個核細胞(BMMNC)中CTSB、CTSL mRNA的表達水平均明顯高于良性血液病患者(P＜0.05)。在AML中存在V

6、EGFmRNA的過度表達,其表達水平明顯高于良性血液病組(P＜0.05)。在AML中,CTSB、CTSL與VEGF三者間的mRNA的表達相互間存在顯著正相關(guān)性。在初診的AML組中CTSB、CTSL及VEGF高表達與AML緩解率及髓外浸潤相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 本研究表明VEGF、組織蛋白酶B、L在骨髓細胞中的表達水平與AML的發(fā)生發(fā)展及髓外浸潤密切相關(guān),同時三者在此過程中還可能相互調(diào)控,共同完成侵襲轉(zhuǎn)移的過程。隨著對組