鹿角盤提取物的體外抗骨質(zhì)疏松作用.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退行性改變，骨的脆性增加，易于發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨骼疾病，多發(fā)于絕經(jīng)后婦女及老年人。骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病率高，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康，并給社會(huì)和國(guó)家?guī)?lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，用于治療骨質(zhì)疏松癥的西藥，如鮭魚降鈣素、雙膦酸鹽類和重組人甲狀旁腺素等，具有明顯的副作用且價(jià)格昂貴。因此，研究開發(fā)安全、高效、經(jīng)濟(jì)的抗骨質(zhì)疏松癥藥物已成為目前的研究熱點(diǎn)。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，鹿角盤具有溫補(bǔ)肝腎、強(qiáng)

2、筋健骨、活血消腫等作用。
　　經(jīng)我們課題組前期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鹿角盤微切助粉對(duì)去卵巢大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型有明顯且良好的治療效果。但是，關(guān)于鹿角盤防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制至今仍未有報(bào)道。因此，本論文旨在系統(tǒng)地研究鹿角盤提取物對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞骨形成功能和破骨細(xì)胞骨吸收活性的影響，并進(jìn)一步探討其防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)采用微切變-助劑互作技術(shù)加工制備鹿角盤微切助粉。然后經(jīng)粒徑分析及

3、掃描電鏡觀察分析細(xì)胞的破碎程度，并檢測(cè)其中與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的活性物質(zhì)的含量。
　　粒徑分析及掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)微切變-助劑互作技術(shù)處理后，鹿角盤微切助粉在粒徑1～30μm范圍內(nèi)的顆粒數(shù)占82.73％，且細(xì)胞已被充分破碎，細(xì)胞內(nèi)有效成分被暴露出來(lái)，呈釋放的狀態(tài)?；钚晕镔|(zhì)含量分析結(jié)果顯示，鹿角盤微切助粉中含有328.79±34.21 pmol/L雌二醇、25.38±4.48 nmol/L睪酮、17.56±3.45 nmol/L孕

4、酮，0.750±0.033μg/g類胰島素生長(zhǎng)因子-1，16.17±0.52 mg/L檸檬酸鈣和133.61±3.55 mg/L鈣，而不含有延胡索酸鈣。且這些活性物質(zhì)的含量均高于其粗粉，說(shuō)明微切變-助劑互作技術(shù)增加了目標(biāo)活性物質(zhì)的溶出量，有利于鹿角盤中活性成分的釋放，體現(xiàn)了該技術(shù)的優(yōu)越性。
　　(2)以人類成骨樣細(xì)胞MG-63為研究對(duì)象，系統(tǒng)地研究了鹿角盤提取物（水提物和醇提物）對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和礦化的影響及其防治骨質(zhì)疏松癥的

5、可能作用機(jī)制。
　　LDH活性檢測(cè)和細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果表明，鹿角盤提取物對(duì)成骨細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用。采用結(jié)晶紫試驗(yàn)、中性紅吸收試驗(yàn)、臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)、MTT法和ALP活性檢測(cè)考察細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化情況。結(jié)果表明，鹿角盤提取物不僅刺激了成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，而且還促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化。此外，茜素紅-S染色和4-羥脯氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果顯示，鹿角盤提取物是通過促進(jìn)鈣的沉積和增加I型膠原蛋白的合成和分泌，促進(jìn)礦化骨基質(zhì)的形成，從而發(fā)揮促進(jìn)骨形成

6、的作用。采用ELISA法和RT-PCR分別檢測(cè)了OPG和RANKL的蛋白含量和mRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示，鹿角盤提取物極顯著地增加了成骨細(xì)胞中OPG蛋白含量和OPG mRNA的表達(dá)量，而降低了RANKL蛋白含量和RANKL mRNA的表達(dá)量，提高了成骨細(xì)胞中OPG/RANKL的比值，間接地抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟，從而起防治骨質(zhì)疏松癥的作用。
　　(3)以RAW264.7細(xì)胞作為一種破骨前體細(xì)胞模型，誘導(dǎo)其分化成破骨細(xì)胞，并研究鹿

7、角盤提取物對(duì)破骨細(xì)胞的形成和骨吸收活性的影響。
　　TRAP染色和破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，用50 ng/mL RANKL成功地誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化成為成熟的破骨細(xì)胞。而且鹿角盤提取物可劑量依賴性地減少破骨細(xì)胞的數(shù)量，降低破骨細(xì)胞中TRAP的活性，從而抑制了RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化形成成熟的破骨細(xì)胞。LDH活性檢驗(yàn)、PI染色和DNA碎片定量分析結(jié)果一致表明，鹿角盤提取物是通過誘導(dǎo)成熟的破骨細(xì)胞發(fā)生凋亡而抑制其活性

8、。而且，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明鹿角盤提取物是通過下調(diào)破骨細(xì)胞表型基因TRAP mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)，來(lái)抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性，從而起防治骨質(zhì)疏松癥的作用。
　　(4)采用p38特異性抑制劑SB203580干預(yù)處理MG-63成骨細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證鹿角盤提取物的抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制。
　　用p38特異性抑制劑SB203580干預(yù)處理成骨細(xì)胞，然后采用MTT法、ALP法、茜素紅-S染色和4-羥脯氨酸含量的檢測(cè)分

9、別評(píng)價(jià)SB203580對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化的影響。結(jié)果表明，SB203580可以有效地阻斷鹿角盤提取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化骨基質(zhì)形成的促進(jìn)作用。而且，用ELISA法和RT-PCR檢測(cè)OPG和RANKL蛋白含量和基因的表達(dá)，結(jié)果顯示鹿角盤提取物上調(diào)了OPG蛋白和mRNA的表達(dá)，下調(diào)了RANKL蛋白和mRNA的表達(dá)，且通過調(diào)控成骨細(xì)胞中OPG和RANKL的表達(dá)，間接地抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟。而SB203580能有效地阻斷鹿角