銀杏葉提取物體外抗乙型肝炎病毒分泌抗原的作用.pdf

1、目的:
　　探討不同濃度的銀杏葉提取物(EGb761)對乙型肝炎病毒分泌抗原的作用，進一步研究中藥在抗乙型肝炎病毒感染過程中的價值。
　　方法:
　　第一部分:
　　1.用MTT法檢測銀杏葉提取物對HepG2.2.15細胞的毒性作用。
　　2.用不同濃度的銀杏葉提取物作用于HepG2.2.15細胞，期間分不同的時間段(4d和6d)收集細胞培養(yǎng)上清，用時間分辨免疫熒光分析(TRFIA)法檢測細胞培養(yǎng)上清中乙肝

2、病毒表面抗原(HBsAg)及乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表達情況。用spss16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，分析EGb761對HepG2.2.15細胞分泌抗原的作用。
　　第二部分:用人乙型肝炎病毒(HBV)陽性血清和銀杏葉提取物作用于HL-7702細胞株和樹鼩原代肝細胞，在不同的時間點（4d和6d）收集細胞培養(yǎng)上清液和細胞DNA，用TRFIA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg;用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法檢測細胞內(nèi)的HBV DN

3、A。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1.MTT實驗顯示:分別在細胞培養(yǎng)的第4天和第6天進行MTT實驗，檢測實驗組吸光度值A(chǔ)(OD)與對照組吸光度值A(chǔ)(OD)，經(jīng)單因素方差分析沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.HepG2.2.15細胞經(jīng)不同濃度的EGb761干預(yù)后，第4天和第6天的細胞培養(yǎng)上清中HBsAg吸光度 A值及HBeAg吸光度A值，明顯少于未加藥作用過的陽性對照組細胞培養(yǎng)上清中的乙肝病毒抗原吸光度

4、A值，經(jīng)單因素方差分析，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3.HepG2.2.15細胞經(jīng)不同濃度的EGb761干預(yù)后，EGb761的濃度在55μg/ml～1750μg/ml的劑量范圍內(nèi)，4d時細胞培養(yǎng)上清中的HBsAg吸光度A值小于6d時對應(yīng)藥物濃度的細胞培養(yǎng)上清中HBsAg吸光度A值，4d時EGb761對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg的抑制率大于6d時對應(yīng)藥物濃度對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg的抑制率;而EG

5、b761的濃度在219μg/ml～1750μg/ml的劑量范圍內(nèi)，雖然4d時細胞培養(yǎng)上清中的HBeAg吸光度A值大于6d時對應(yīng)藥物濃度的細胞培養(yǎng)上清中HBeAg吸光度A值，但是4d時EGb761對HepG2.2.15細胞分泌HBeAg的抑制率有大于6d時對應(yīng)藥物濃度對HepG2.2.15細胞分泌HBeAg的抑制率。
　　4.HepG2.2.15細胞經(jīng)不同濃度的EGb761作用4d和6d后，27μg/ml及以上的濃度范圍時測得的細胞

6、培養(yǎng)上清中的HBsAg吸光度A值與陽性對照組的吸光度A值比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);219μg/ml及以上的濃度范圍時測得的細胞培養(yǎng)上清中的HBeAg吸光度A值與陽性對照組的吸光度A值比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　第二部分:
　　銀杏葉提取物干預(yù)過的感染了人HBV的HL-7702細胞株和樹鼩原代肝細胞培養(yǎng)上清中的HBsAg呈陽性，HL-7702細胞株培養(yǎng)上清中的HBsAg的吸光度A值在一倍稀釋濃度4d時與相應(yīng)

7、的陽性對照組A值比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);細胞內(nèi)的HBV DNA經(jīng)PCR后灰度值沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律變化趨勢。
　　結(jié)論:
　　1.本實驗應(yīng)用EGb761的劑量在14μg/ml～1750μg/ml對 HepG2.2.15細胞的生長沒有明顯的毒性作用;
　　2.經(jīng)EGb761干預(yù)過4d和6d的HepG2.2.15細胞，EGb761的劑量濃度范圍在27μg/ml～1750μg/ml時對細胞分泌到培養(yǎng)上清中的HBsA

8、g的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng);而在219μg/ml～1750μg/ml的劑量范圍內(nèi)時對細胞分泌到培養(yǎng)上清中的HBeAg的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng);
　　3.HepG2.2.15細胞經(jīng)不同濃度的EGb761作用4d和6d后，EGb761在較低的濃度范圍內(nèi)就可以抑制HepG2.2.15細胞向培養(yǎng)上清中分泌HBsAg;而抑制細胞分泌HBeAg到培養(yǎng)上清中卻需要較高的藥物濃度，并且EGb761對HBsAg的抑制率有強于對HBeAg的抑制率

9、的趨勢。
　　4.經(jīng)EGb761干預(yù)過的HepG2.2.15細胞，4d時對乙肝抗原的抑制率有強于6d時抑制率的趨勢。
　　5.EGb761的濃度在27μg/ml時可能是抑制HBsAg分泌的最低有效劑量濃度，同樣EGb761的濃度在219μg/ml時可能是抑制HBeAg分泌的最低有效劑量濃度。
　　6.HL-7702細胞株可能能夠被人HBV陽性感染血清所感染，但是不能用其作為研究自然狀態(tài)下感染HBV的細胞模型。