牛卵母細(xì)胞抽提物對(duì)人肺癌細(xì)胞的表觀遺傳重編程作用研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康與生命的一類疾病。傳統(tǒng)的腫瘤治療手段是使用手術(shù)切除病灶以及通過放療和化療殺滅腫瘤細(xì)胞。但是，手術(shù)難以切除微小播散病灶;放療與化療不僅缺乏特異性，使身體內(nèi)大量的正常細(xì)胞受到嚴(yán)重的損傷，而且具有加速腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步惡化的風(fēng)險(xiǎn)。因此，很有必要跳出以往著眼于移除和殺滅腫瘤細(xì)胞的思路，為腫瘤研究尋找新的方向、為腫瘤治療提供新的手段。
　　卵母細(xì)胞抽提物介導(dǎo)的表觀遺傳重編程是近年新發(fā)展起來的一種重編程方法。它使用卵母細(xì)

2、胞的核、質(zhì)或全細(xì)胞抽提物去孵育經(jīng)可逆通透的目標(biāo)細(xì)胞，在孵育過程中，抽提物中的重編程因子可進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞中，使目標(biāo)細(xì)胞的表觀遺傳修飾和基因表達(dá)模式發(fā)生改變，最終使其脫離原有的發(fā)育程序、獲得新的發(fā)育命運(yùn)。研究表明，表觀遺傳調(diào)控紊亂在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。我們考慮，用卵母細(xì)胞抽提物作用于腫瘤細(xì)胞，有望改變腫瘤細(xì)胞的表觀遺傳修飾，使其脫離異常發(fā)育程序，重新獲得向正常細(xì)胞發(fā)育的能力。
　　本實(shí)驗(yàn)首次使用牛的MII期、GV期和孤雌激

3、活卵母細(xì)胞抽提物處理H460人肺癌細(xì)胞，從表觀遺傳修飾、基因表達(dá)和細(xì)胞功能三個(gè)層面上觀察了卵母細(xì)胞抽提物對(duì)人肺癌細(xì)胞的重編程效應(yīng)。結(jié)果顯示:
　　1.牛卵母細(xì)胞抽提物能夠逆轉(zhuǎn)H460人肺癌細(xì)胞中抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島超甲基化
　　牛MII期、GV期和孤雌激活卵母細(xì)胞抽提物處理H460細(xì)胞，均能使抑癌基因RUNX3和CDH1超甲基化的啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生顯著去甲基化，其中RUNX3啟動(dòng)子區(qū)CpG島的DNA甲基化水平分別降低了

4、30.44％、40.29％和33.81％，CDH1啟動(dòng)子區(qū)CpG島的DNA甲基化水平分別降低了36.36％、42.57％和39.36％。不同發(fā)育期卵母細(xì)胞抽提物誘導(dǎo)的去甲基化都不是在兩CpG島內(nèi)各CpG位點(diǎn)上均勻發(fā)生，而是更多的集中在一些特定的CpG位點(diǎn)上;位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列內(nèi)的CpG位點(diǎn)具有較高的去甲基化率。
　　2.牛卵母細(xì)胞抽提物能夠改變H460人肺癌細(xì)胞中抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾模式
　　牛MII期、GV期和孤雌

5、激活卵母細(xì)胞抽提物處理H460細(xì)胞，均能降低抑癌基因RUNX3和CDH1啟動(dòng)子區(qū)抑制性組蛋白修飾H3K27me3和H3K9me3的水平，其中MII期卵母細(xì)胞抽提物降低H3K27me3修飾水平的能力最強(qiáng)，不同發(fā)育期卵母細(xì)胞抽提物降低H3K9me3修飾水平的能力相當(dāng);MII期卵母細(xì)胞抽提物對(duì)RUNX3和CDH1啟動(dòng)子區(qū)活化性組蛋白修飾H3K9ac和H3K4me3的水平均無影響，GV期卵母細(xì)胞抽提物可升高RUNX3啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac和H3K

6、4me3修飾的水平以及CDH1啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac修飾的水平，孤雌激活卵母細(xì)胞抽提物可升高RUNX3和CDH1啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3修飾的水平。
　　3.牛卵母細(xì)胞抽提物能夠激活H460人肺癌細(xì)胞中抑癌基因的表達(dá)
　　牛MII期、GV期和孤雌激活卵母細(xì)胞抽提物處理H460細(xì)胞，均能激活抑癌基因RUNX3和CDH1的表達(dá)。兩基因的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)變化在不同處理組中具有差異，MII期卵母細(xì)胞抽提物處理組中RUNX3和CDH1的轉(zhuǎn)錄水平在

7、培養(yǎng)6h時(shí)即大幅升高，6h后至48 h時(shí)又略有升高;GV期和孤雌激活卵母細(xì)胞抽提物處理組中RUNX3和CDH1的轉(zhuǎn)錄水平在培養(yǎng)6h時(shí)升幅較小，6h后至48 h時(shí)大幅升高。培養(yǎng)48 h時(shí)，不同發(fā)育期卵母細(xì)胞抽提物處理組間RUNX3和CDH1的轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異。
　　各發(fā)育期卵母細(xì)胞抽提物處理組中RUNX3和CDH1的蛋白表達(dá)均從培養(yǎng)24 h時(shí)開始被激活。
　　4.牛卵母細(xì)胞抽提物對(duì)抑癌基因的作用具有特異性
　　牛MII

8、期、GV期和孤雌激活卵母細(xì)胞抽提物對(duì)H460細(xì)胞中抑癌基因RUNX3和CDH1的表觀遺傳重塑和轉(zhuǎn)錄激活均具有特異性。它們都不引起重復(fù)序列alpha satellite和retroviral long terminal repeat sequence of minisatellite MS32的去甲基化，也不上調(diào)多能性基因OCT4、NANOG、KLF4和SOX2的轉(zhuǎn)錄。孤雌激活卵母細(xì)胞抽提物還可使多能性基因SOX2啟動(dòng)子區(qū)的抑制性組蛋白修

9、飾H3K27me3增多，活化性組蛋白修飾H3K9ac減少，進(jìn)而下調(diào)SOX2的表達(dá)。
　　5.牛卵母細(xì)胞抽提物能夠抑制H460人肺癌細(xì)胞的惡性表型
　　牛MII期、GV期和孤雌激活卵母細(xì)胞抽提物均能顯著抑制H460細(xì)胞的惡性表型。與對(duì)照組細(xì)胞相比，三個(gè)處理組細(xì)胞的增殖能力分別降低了24.88％、26.42％和26.38％，錨定非依賴型生長能力分別降低了60.56％、53.18％和54.71％，遷移能力分別降低了40.72％、4

10、6.93％和35.20％，侵襲能力分別降低了78.05％、83.33％和73.81％。
　　結(jié)論
　　牛MII期、GV期和孤雌激活卵母細(xì)胞抽提物處理H460人肺癌細(xì)胞，均能使抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)超甲基化的CpG島發(fā)生顯著去甲基化，并重塑抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白修飾模式，從而激活抑癌基因的表達(dá)。牛卵母細(xì)胞抽提物對(duì)抑癌基因的作用具有特異性，并不引起重復(fù)序列的去甲基化以及多能性基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)。最終癌細(xì)胞的增殖、錨定非依賴型生長、遷移和