豬血管內(nèi)皮細(xì)胞對人血清適應(yīng)狀態(tài)的建立及發(fā)生機(jī)理的研究.pdf

1、異種移植是解決供體器官短缺的有效辦法，然而其異常強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)阻礙了其在臨床上的應(yīng)用。適應(yīng)作為介于排斥和耐受之間的一種狀態(tài)得到大家廣泛的關(guān)注，并將其作為克服急性血管性排斥反應(yīng)(acutevascularrejection，AVR)的一個(gè)途徑。本研究即是基于上述的認(rèn)識(shí)，通過培養(yǎng)豬主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(PorcineArteriaeEndothelialCell，PAEC)，以多種形式誘導(dǎo)其適應(yīng)狀態(tài)的發(fā)生，并采用基于PCR的改良消減雜交技術(shù)對

2、PAEC適應(yīng)前后差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選、測序，以獲取適應(yīng)狀態(tài)PAEC可能發(fā)生的生物反應(yīng)的信息，為研究適應(yīng)的發(fā)生機(jī)制尋找線索。 本研究分為三部分，分別總結(jié)如下：第一部分豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定目的：通過PAEC的培養(yǎng)與鑒定，為異種移植體外實(shí)驗(yàn)研究模型的建立提供材料和方法。方法：自試驗(yàn)用乳豬采血制備豬的自體血清，在麻醉下切取豬的主動(dòng)脈，以1％膠原酶Ⅰ消化法獲取血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，并分別以胎牛血清、豬自體血清進(jìn)行繼續(xù)

3、培養(yǎng)，繪制生長曲線，推算倍增時(shí)間以及貼壁率，采用DiI-Ac-LDL吸收試驗(yàn)鑒定細(xì)胞類型和純化程度。結(jié)果：初步觀察豬自體血清進(jìn)行原代培養(yǎng)其貼壁率為92.3％高于胎牛血清培養(yǎng)組87.6％，倍增時(shí)間19.02hr快于胎牛血清組的22.46hr，兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)無差別。經(jīng)DiI-Ac-LDL吸收試驗(yàn)確定培養(yǎng)細(xì)胞為PAEC，未見雜細(xì)胞的污染。結(jié)論：采用活體狀態(tài)下取材和控制胰蛋白酶使用量和作用時(shí)間有助于保持細(xì)胞的活力，通過控制膠原酶消化時(shí)間和避免沾

4、染血管內(nèi)皮外的組織、接種后3hr內(nèi)換液等方法能夠最大限度避免雜細(xì)胞的污染，采用豬自體血清利于細(xì)胞的貼壁和增殖。 第二部分PAEC對人血清適應(yīng)細(xì)胞模型的建立及評估目的：對比人IgG、IgM和正常人AB型血清誘導(dǎo)PAEC適應(yīng)狀態(tài)的效果，分析適應(yīng)的發(fā)生原因。方法：分別以IgG、IgM和低濃度正常人AB型血清誘導(dǎo)PAEC6d，然后與25％正常人AB型血清共孵育2hr，以MTT比色法檢測細(xì)胞存活率，并以免疫組化方法檢測其HO-1和Bcl-

5、2表達(dá)的情況；分別以正常人AB型血清、胎牛血清和補(bǔ)體滅活的胎牛血清作用于PAEC，觀察PAEC抗補(bǔ)體依賴性細(xì)胞溶解殺傷作用的能力。結(jié)果：在25％的正常人AB型血清作用下，PAEC的存活率為71±22％，100μg/mlIgM和5％、10％正常人AB型血清能夠誘導(dǎo)PAEC適應(yīng)狀態(tài)的發(fā)生，HO-1、Bcl-2表達(dá)增加，而以補(bǔ)體未滅活胎牛血清誘導(dǎo)PAEC亦可產(chǎn)生對正常人AB型血清溶解殺傷作用的抵抗能力。結(jié)論：天然抗體以及細(xì)胞致傷信號(hào)可能是導(dǎo)致

6、適應(yīng)發(fā)生的原因，后者效果更為明顯。 第三部分豬血管內(nèi)皮細(xì)胞適應(yīng)狀態(tài)差異表達(dá)基因的克隆及初步分析目的：建立PAEC適應(yīng)模型，克隆適應(yīng)后表達(dá)差異的基因，根據(jù)基因功能分析適應(yīng)的發(fā)生機(jī)制。方法：以5％正常人AB型血清誘導(dǎo)PAEC，應(yīng)用基于PCR的改良消減雜交技術(shù)克隆差異表達(dá)基因，測序并行Blast分析。結(jié)果：測序21個(gè)克隆，經(jīng)Blast分析其中9個(gè)克隆為已知序列，4個(gè)克隆不能明確分類，5個(gè)可能是未知基因。在已知序列中有6個(gè)基因，分別是血

7、紅素氧化酶1(HemeOxidase-1，HO-1)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactiveprotein，CRP)、纖維素樣蛋白-2(Fibrinogen-likeprotein2，F(xiàn)GL2)、脂連接素受體(adiponectinreceptor1，adipoR1)和T細(xì)胞受體片段等基因，其中HO-1與抗凋亡有關(guān)，C-RP、FGL2、T細(xì)胞受體基因與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)有關(guān)，因此推測適應(yīng)狀態(tài)的PAEC不僅存在抗損傷的防御反應(yīng)，也存在損傷后的