可溶性HLA-G-,1-抑制人NK細胞對豬血管內(nèi)皮細胞殺傷作用的研究.pdf

1、第一部分穩(wěn)定表達可溶性HLA-G1的真核細胞系的建立 目的:建立穩(wěn)定表達可溶性HLA-G1(solublehumanleucocyteantigenG1，sHLA-G1)的真核細胞系。方法:采用核轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有sHLA-G1基因的質(zhì)粒pcDNA3-sHLA-G1轉(zhuǎn)入不表達HLA-Ⅰ類分子的B淋巴瘤細胞LCL721.221中，轉(zhuǎn)染率約為16％。經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，通過RT-PCR及Dot-ELISA分別在基因和蛋白質(zhì)

2、水平鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞是否表達目的基因sHLA-G1。結(jié)果:經(jīng)RT-PCR和Dot-ELISA鑒定證實轉(zhuǎn)染細胞可表達sHLA-G1。結(jié)論:采用核轉(zhuǎn)染方法可以成功建立穩(wěn)定表達可溶性sHLA-G1的真核細胞系。 第二部分三種非病毒載體轉(zhuǎn)染方法對貼壁細胞及懸浮細胞轉(zhuǎn)染的比較 目的:通過檢測三種非病毒載體轉(zhuǎn)染方法(傳統(tǒng)電穿孔法、脂質(zhì)體法及新興的核轉(zhuǎn)染法)對貼壁細胞及懸浮細胞的轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后細胞的存活率，以比較這三種轉(zhuǎn)染方法的優(yōu)缺

3、點。方法:選取貼壁生長的宮頸癌細胞系Hela細胞及懸浮生長的B淋巴瘤細胞系LCL721.221細胞作為宿主細胞，以含有綠色熒光蛋白(GFP)基因的pEGFP-C1為報告質(zhì)粒，分別用傳統(tǒng)電穿孔法、脂質(zhì)體法及核轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染細胞。用臺盼藍染色檢測轉(zhuǎn)染后細胞存活率并于轉(zhuǎn)染后24h和48h用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染細胞的GFP表達率(即轉(zhuǎn)染效率)。結(jié)果:采用傳統(tǒng)電穿孔法細胞存活率為：Hela，85.3％，LCL721.221，87.6％，轉(zhuǎn)染

4、效率為：Hela,約5％；LCL721.221，約1％；采用脂質(zhì)體法細胞存活率為：Hela,73.4％，LCL721.221，68.2％，轉(zhuǎn)染效率為：Hela,約40％，LCL721.221，約0.4％；采用核轉(zhuǎn)染法細胞存活率為：Hela,91.6％，LCL721.221，90.7％，轉(zhuǎn)染效率為：Hela,約95％，LCL721.221，約16％。采用核轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染的細胞存活率及轉(zhuǎn)染效率均最高。結(jié)論:細胞系的轉(zhuǎn)染，特別是難轉(zhuǎn)染細胞系的轉(zhuǎn)染

5、，核轉(zhuǎn)染法可以作為非病毒載體轉(zhuǎn)染方法的首選。 第三部分可溶性HLA-G1抑制人NK細胞對豬血管內(nèi)皮細胞殺傷作用的研究 目的:研究可溶性HLA-G1能否抑制人自然殺傷細胞(NK細胞)對豬血管內(nèi)皮細胞系殺傷的作用。方法:用免疫親和層析法從轉(zhuǎn)染sHLA-G1基因的LCL721.221細胞培養(yǎng)液上清液中提純sHLA-G1蛋白，將不同濃度的sHLA-G1(2，4，6，8μg/ml)加入到效應(yīng)細胞為NK92細胞，靶細胞為豬血管內(nèi)皮細