DNAM-1-nectin-2信號途徑介導(dǎo)人NK細(xì)胞對豬內(nèi)皮細(xì)胞直接殺傷作用的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：豬nectin-2 分子的生物信息學(xué)預(yù)測、克隆及分析鑒定
　　 目的：證明豬nectin-2基因的存在，分析并克隆出nectin-2基因，明確其分子結(jié)構(gòu)特點及表達(dá)特性。
　　 方法：運用生物信息學(xué)方法從美國基因數(shù)據(jù)庫（GenBank）獲得與人nectin-2基因同源的豬EST序列，通過RT-PCR、3’RACE等技術(shù)在豬內(nèi)皮細(xì)胞系SV-40-PED中驗證該序列的準(zhǔn)確性，并研究其

2、組織表達(dá)分布特點，利用體細(xì)胞雜交板（somatic cell hybridpanel，SCHP）技術(shù)對其進(jìn)行染色體定位。根據(jù)反向PCR原理擴(kuò)增該基因5’端調(diào)控區(qū)的未知序列。參照同源分子人PVR蛋白胞膜外區(qū)的三級結(jié)構(gòu)，利用生物序列分析軟件及數(shù)據(jù)庫構(gòu)建豬nectin-2蛋白胞膜外區(qū)的三維空間結(jié)構(gòu)模型。
　　 結(jié)果：通過克隆測序與同源性分析，發(fā)現(xiàn)豬存在necin-2 分子，其包含α、δ 2種剪接體，它們具有相同的胞膜外區(qū)序列與不同的跨

3、膜區(qū)和胞漿區(qū)序列，將此結(jié)果提交至美國基因數(shù)據(jù)庫（GenBank），并認(rèn)定為我們新發(fā)現(xiàn)的基因，分別獲得登錄號EF195266和EU069826。Necin-2 在豬的各種組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，尤其在豬內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)豐富。SCHP結(jié)果顯示豬necin-2 定位于6號染色體q21 區(qū)域。通過反向PCR技術(shù)從豬nectin-2α的5’端非編碼區(qū)延伸出371bp的未知序列。三維空間結(jié)構(gòu)顯示豬nectin-2 蛋白胞膜外區(qū)形成V-C-C 3個免疫球蛋

4、白樣結(jié)構(gòu)域，其中V樣結(jié)構(gòu)域由9個β折疊構(gòu)成。
　　 結(jié)論：生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)的聯(lián)合使用，有助于豬的新基因的發(fā)現(xiàn)與鑒定。本研究證實了豬存在nectin-2基因的推測，明確了該基因相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息，為研究nectin-2的免疫學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：豬nectin-2 胞膜外區(qū)融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)與純化
　　 目的：構(gòu)建具有模擬天然nectin-2 分子與受體DNAM-1 相結(jié)合能力的胞膜外區(qū)融

5、合蛋白nectin-2ED-IgGFc。
　　 方法:利用RT-PCR 擴(kuò)增豬nectin-2 胞膜外區(qū)基因片段，連接至T 載體，測序無誤后，亞克隆至真核表達(dá)載體CD5lneg1，構(gòu)建出重組質(zhì)粒nectin-2ED-CD5lneg1。將重組質(zhì)粒和空載體CD5lneg1 分別轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，用嘌呤霉素進(jìn)行篩選;通過Western Blot、細(xì)胞免疫化學(xué)、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測，鑒定出能穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白nectin-2ED

6、-IgGFc和IgGFc 蛋白的細(xì)胞株。利用蛋白A+G 瓊脂糖珠親和層析法分離、純化融合蛋白。
　　 結(jié)果:經(jīng)過雙酶切和測序鑒定，重組質(zhì)粒nectin-2ED-CD5lneg1 構(gòu)建成功。嘌呤霉素篩選出能穩(wěn)定表達(dá)nectin-2ED-IgGFc 融合蛋白和IgGFc 蛋白的CHO細(xì)胞，從其細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離、純化出高純度的融合蛋白。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建并表達(dá)出融合蛋白nectin-2ED-IgGFc，該蛋白可作為豬ne

7、ctin-2與人DNAM-1 相互作用研究的重要工具。
　　 第三部分：DNAM-1-nectin-2 途徑介導(dǎo)人NK細(xì)胞殺傷豬內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究
　　 目的:研究豬nectin-2與人DNAM-1 異種受體配體之間的結(jié)合能力，建立能客觀有效地評價人NK細(xì)胞對豬內(nèi)皮細(xì)胞殺傷效果的實驗方法，比較不同人NK細(xì)胞系（包括NK92和YT細(xì)胞系）對豬內(nèi)皮細(xì)胞的異種殺傷能力。
　　 方法:利用流式細(xì)胞術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)檢測融

8、合蛋白nectin-2ED-IgGFc與YT細(xì)胞系的DNAM-1之間的親和能力。通過Western Blot 比較DNAM-1 在NK92與YT細(xì)胞系中的表達(dá)水平，用流式細(xì)胞術(shù)檢測融合蛋白和抗DNAM-1中和性抗體與YT細(xì)胞結(jié)合的效率。建立用CFSE/PI 雙染法檢測NK92和YT細(xì)胞系對豬內(nèi)皮細(xì)胞系（SV-40-PED）細(xì)胞毒作用的方法，比較NK92與YT細(xì)胞異種殺傷效應(yīng)的差異。
　　 結(jié)果:融合蛋白nectin-2ED-Ig

9、GFc 能與人YT細(xì)胞表面的DNAM-1發(fā)生特異性結(jié)合。NK92與YT細(xì)胞DNAM-1的表達(dá)量無明顯差異。YT細(xì)胞在與終濃度為10μg/ml的抗DNAM-1中和性抗體于室溫孵育1h后，抗體與YT細(xì)胞的結(jié)合率為48.53%。通過CFSE/PI 雙染法檢測到，當(dāng)效靶比為10:1，共同孵育時間為5、6和7 小時后，對豬內(nèi)皮細(xì)胞系（SV-40-PED）的殺傷率人NK92細(xì)胞分別為44.68%、53.99%和57.44%，人YT細(xì)胞分別為20.4