槐耳抑制乳腺癌的分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及53BP1抑癌分子通路研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是全世界女性常見的惡性腫瘤之一。隨著人們對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的深入，“乳腺癌是一種全身性疾病”這一論點(diǎn)已被人們廣泛接受，在此認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，乳腺癌的治療已發(fā)展成集手術(shù)治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療及生物靶向治療及中醫(yī)藥治療等多種方式于一體的綜合治療體系。
　　中藥作為乳腺癌系統(tǒng)性輔助治療的一部分，在乳腺癌治療中的應(yīng)用已引起越來(lái)越多的重視。中藥的每種組成成分通常具有多種作用，且各組成成分之間又有復(fù)雜的相互作用，因此重要通常

2、為多靶點(diǎn)作用方式，具有辨證性及整體性，在癌癥治療的臨床應(yīng)用中有其獨(dú)到的作用及廣泛的應(yīng)用前景。
　　槐耳是一種具有抗癌作用的中藥，其正式問(wèn)世時(shí)是作為原發(fā)性肝癌的輔助用藥之一，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其有明顯的抗肝癌作用，但其作用機(jī)制尚不完全明確。隨后，槐耳開始應(yīng)用在乳腺癌的輔助治療中，且在臨床應(yīng)用中也表現(xiàn)出其抗癌性。作為中藥的典型代表，槐耳的作用同樣具有辨證性和整體性，因此，對(duì)其作用機(jī)制的研究也必須從全面、整體的角度出發(fā)，而不能局限在傳統(tǒng)的研究

3、方法中。
　　基因芯片是一種近幾十年間迅速發(fā)展起來(lái)的新興技術(shù)，利用基因芯片技術(shù)可以檢測(cè)數(shù)以千計(jì)甚至數(shù)以萬(wàn)計(jì)的基因表達(dá)信息。利用基因芯片檢測(cè)出的基因信息進(jìn)行深入的數(shù)據(jù)分析，可以深層次挖掘差異基因所涉及的功能及分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)下一步的深入研究提供指導(dǎo)幫助。
　　因此，本論文的目的就是利用基因表達(dá)譜芯片這一技術(shù)，對(duì)槐耳抑制乳腺癌的作用機(jī)制展開全面檢測(cè)及分析。利用基因芯片技術(shù)，我們將篩選出槐耳作用于乳腺癌細(xì)胞所引起的發(fā)生顯著性變

4、化的功能及分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，揭示槐耳抑制乳腺癌的分子機(jī)制，并為后續(xù)深入研究提供指導(dǎo)。同時(shí)，我們也將定位在槐耳抑制乳腺癌中起到關(guān)鍵作用的基因，并對(duì)其功能和作用機(jī)制展開深入研究，力求為乳腺癌的新藥研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　為了研究槐耳抑制乳腺癌細(xì)胞的具體作用機(jī)制，我們首先用MTT的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了槐耳對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞抑制作用，并根據(jù)MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇適宜的藥物作用濃度和作用時(shí)間，以

5、刺激乳腺癌細(xì)胞。然后，從經(jīng)槐耳刺激的乳腺癌細(xì)胞中提取RNA，進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片的檢測(cè)。從芯片結(jié)果中，利用倍數(shù)法的方法初步篩選出表達(dá)差異基因，并用實(shí)時(shí)定量PCR的方法對(duì)芯片中的部分結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。然后通過(guò)Gene Ontology(GO)分析對(duì)表達(dá)差異基因參與的生物學(xué)功能進(jìn)行研究，通過(guò)Pathway分析對(duì)表達(dá)差異基因參與的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行分析。最后，將GO分析得到的有顯著變化的差異基因和Pathway分析得到的差異基因取交集，在Kyot

6、o Encyclopedia of Genes andGenomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)的指導(dǎo)下，將交集基因繪制成能夠直觀反映變化的關(guān)鍵基因的基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，從而揭示槐耳作用于乳腺癌細(xì)胞的多靶點(diǎn)作用方式。
　　在基因芯片結(jié)果的提示下，我們通過(guò)Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR的方法，對(duì)潛在的關(guān)鍵抑癌基因53BP1的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè)。為了拓展研究53BP1的基因功能，我們通過(guò)構(gòu)建載體和細(xì)胞轉(zhuǎn)染等方法，篩選出53BP1過(guò)表

7、達(dá)及干擾的乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究。我們通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察、Western blot、實(shí)時(shí)定量PCR和細(xì)胞免疫熒光化學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)篩選出的乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標(biāo)志性分子的表達(dá)變化。然后，用Transwell的實(shí)驗(yàn)方法探究53BP1對(duì)乳腺癌細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響。為了明確53BP1抑制乳腺癌細(xì)胞EMT的具體作用機(jī)制，我們采用Western blot和實(shí)時(shí)

8、定量PCR的方法，對(duì)可能的信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)。為明確通路中microRNA（miRNA）的作用，我們向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA mimic及miRNA inhibitor，然后用Westemblot和Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證miRNA在53BP1抑制乳腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用機(jī)制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平，我們構(gòu)建了裸鼠皮下成瘤模型，用免疫組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)腫瘤組織中EMT關(guān)鍵分子的表達(dá)情況，來(lái)驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。最后，我們用實(shí)時(shí)定量PCR

9、的方法，在臨床手術(shù)標(biāo)本組織中檢測(cè)了53BP1、 miRNA和ZEB1等關(guān)鍵分子的表達(dá)，來(lái)進(jìn)一步明確我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著槐耳溶液藥物濃度和作用時(shí)間的增加，兩種乳腺癌細(xì)胞的存活數(shù)量均越來(lái)越少，即槐耳對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。根據(jù)MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇用8mg/mL的槐耳溶液刺激乳腺癌細(xì)胞72h，然后進(jìn)行基因芯片的檢測(cè)。
　　首先，倍數(shù)法初步篩選表達(dá)

10、差異基因的結(jié)果顯示，經(jīng)槐耳刺激后，MDA-MB-231細(xì)胞系中差異基因共有1655個(gè)，其中有907個(gè)基因表達(dá)上升，748個(gè)基因表達(dá)下降;而MCF-7細(xì)胞系中差異基因共有1320個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有600個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有720個(gè)。在兩種乳腺癌細(xì)胞系中，槐耳共同調(diào)節(jié)的差異基因共有172個(gè)，其中98個(gè)發(fā)生上調(diào)，74個(gè)發(fā)生下調(diào)。為了驗(yàn)證基因表達(dá)譜芯片結(jié)果的可信度，我們用實(shí)時(shí)定量PCR的方法對(duì)結(jié)果中的部分基因結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示實(shí)時(shí)定量PCR

11、的結(jié)果與芯片結(jié)果基本相符。
　　然后，我們根據(jù)芯片結(jié)果進(jìn)行了生物功能學(xué)水平的GO分析。結(jié)果顯示在MDA-MB-231細(xì)胞中，共有562個(gè)GO功能發(fā)生顯著差異，其中353個(gè)GO功能發(fā)生上調(diào)，209個(gè)GO功能發(fā)生下調(diào);而在MCF-7細(xì)胞中，共有695個(gè)GO功能發(fā)生顯著差異，其中307個(gè)GO功能發(fā)生上調(diào)，388個(gè)GO功能發(fā)生下調(diào)。兩種乳腺癌細(xì)胞系受槐耳共同調(diào)節(jié)的GO功能共有129個(gè)，其中77個(gè)發(fā)生上調(diào)，52個(gè)發(fā)生下調(diào)。
　　然后，

12、我們從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路水平進(jìn)行了Pathway分析，分析結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，槐耳顯著調(diào)節(jié)信號(hào)通路104條，其中59個(gè)通路上調(diào)，45個(gè)通路發(fā)生下調(diào);在MCF-7細(xì)胞中，共有77條通路發(fā)生了顯著變化，其中39條發(fā)生上調(diào)，38條發(fā)生下調(diào)。通過(guò)將兩種細(xì)胞系發(fā)生顯著變化的通路取交集，我們發(fā)現(xiàn)，共有36條通路發(fā)生變化，其中8條上調(diào)，28條下調(diào)。
　　最后，我們分別對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞發(fā)生變化的關(guān)鍵基因構(gòu)建

13、了其分子網(wǎng)絡(luò)圖，并將兩種細(xì)胞系共同發(fā)生變化的分子網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行了繪制，最終得出了槐耳調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的重要分子網(wǎng)絡(luò)。
　　在芯片結(jié)果的提示下，我們發(fā)現(xiàn)，槐耳作用于乳腺癌細(xì)胞后，DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵基因53BP1發(fā)生了明顯上調(diào)，這一結(jié)果與其它DNA損傷修復(fù)通路中的基因變化不符。根據(jù)我們的前期研究結(jié)果，我們推測(cè)在槐耳抑制乳腺癌細(xì)胞這一過(guò)程中，53BP1發(fā)揮了抑癌基因的功能，因此我們對(duì)53BP1基因展開了拓展性研究。
　　在對(duì)篩選

14、出的過(guò)表達(dá)和干擾53BP1的乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)中，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，這一變化提示53BP1可能抑制了乳腺癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，為了明確這一假設(shè)，我們檢測(cè)了EMT過(guò)程中的關(guān)鍵分子，發(fā)現(xiàn)53BP1確實(shí)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)53BP1能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。為了進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，我們檢測(cè)了EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)ZEB1的表達(dá)發(fā)生了顯著改變，提示53BP1可能通過(guò)調(diào)節(jié)ZEB1從而實(shí)

15、現(xiàn)對(duì)EMT的抑制作用。miRNA在乳腺癌的EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而ZEB1又是miR-200家族發(fā)揮作用的靶基因，因此，我們檢測(cè)了miR-200家族5個(gè)miRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-200b和miR-429發(fā)生了最為顯著的變化。然后我們?cè)诟弑磉_(dá)miRNA的細(xì)胞中干擾miRNA，在低表達(dá)miRNA的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)相應(yīng)的miRNA，發(fā)現(xiàn)53BP1所引起的變化均發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，提示53BP1確實(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)miR-200b-429/ZEB1/E

16、-cadherin這一信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)EMT和遷移侵襲能力的抑制。最后，我們從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平和臨床標(biāo)本水平驗(yàn)證了體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　1.槐耳對(duì)乳腺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用。
　　2.槐耳對(duì)乳腺癌的抑制作用呈現(xiàn)多靶點(diǎn)、整體性的特點(diǎn)，涵蓋乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中多個(gè)重要生物學(xué)功能及分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　3.槐耳能夠上調(diào)抑癌基因53BP1的表達(dá)。
　　4.53BP1能夠通過(guò)調(diào)節(jié)miR-200b-429/ZE

17、B1/E-cadherin通路抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。
　　意義：
　　1.用基因表達(dá)譜芯片的方式，揭示了槐耳對(duì)乳腺癌細(xì)胞的多靶點(diǎn)作用方式，為槐耳治療乳腺癌提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并為今后對(duì)槐耳作用機(jī)制的研究提供指導(dǎo)方向。
　　2.從槐耳抑制乳腺癌的基因表達(dá)譜芯片中篩選出抑癌基因53BP1，為新藥開發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。
　　3.研究了53BP1通過(guò)miR-200b-429/ZEB1/E-cadherin通