外周血DD3mRNA定量檢測在前列腺癌診斷和治療監(jiān)測中初步應(yīng)用.pdf

1、目的 采用Taqman-MGB探針技術(shù)，建立熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR)檢測DD3mRNA的方法，并對外周血DD3mRNA定量檢測在前列腺癌診斷和治療監(jiān)測中臨床應(yīng)用進(jìn)行評價(jià)。 方法 1．根據(jù)Genebank的DD3mRNA序列，在DD3基因的外顯子1和3之間設(shè)計(jì)一對引物和一條Taqman-MGB探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，建立DD3mRNA的FQ-RT-PCR方法。 2．用pBluescrip

2、tIISK載體與普通PCR擴(kuò)增所得的DD3cDNA片段進(jìn)行連接，制備重組質(zhì)粒進(jìn)而轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α并進(jìn)行克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。 3．對本方法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，包括探針穩(wěn)定性、靈敏度、特異度和精密度等。 4．用熒光定量RT-PCR方法對35例未治療前列腺癌、58例內(nèi)分泌治療后前列腺癌、59例良性前列腺增生患者和10例健康男性志愿者外周血DD3mRNA含量進(jìn)行定量檢測，并對DD3mRNA診斷及療效監(jiān)測價(jià)值進(jìn)行評價(jià)。

3、 結(jié)果 1．成功建立了熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測DD3mRNA的方法，本方法檢測靈敏度為6拷貝／反應(yīng)，線性范圍為6～6×108拷貝，Ct值與拷貝數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系(R2=0．994)，批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為1．25-2．06％和2．32-3．59％。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆和測序分析顯示本擴(kuò)增片段為DD3序列的特異性片段。 2．未治療前列腺癌組外周血DD3mRNA含量明顯高于治療后前列腺癌組、前列腺增生組和健康男性

4、志愿者組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。前列腺增生組和健康男性志愿者組外周血DD3mRNA含量間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．432)。未治療前列腺癌患者隨著臨床分期增加，外周血DD3mRNA含量也增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。 3．當(dāng)臨．界值為846copies／mi時(shí)，DD3mRNA曲線下面積為0．822(95％．CI：0．725．0．919)，靈敏度、特異度分別為74．3％、89．8％。4．外周血DD3mRN