人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍方案的改良——相關(guān)基礎(chǔ)研究及初期臨床應(yīng)用.pdf

1、第一部分豬體外成熟卵母細(xì)胞經(jīng)梯度體積變化處理后發(fā)育潛能的改變 研究背景：冷凍過(guò)程中滲透壓差和細(xì)胞體積的變化對(duì)卵母細(xì)胞的影響逐漸得到重視。細(xì)胞過(guò)度的擴(kuò)張和收縮可以破壞細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此需要評(píng)估卵母細(xì)胞對(duì)體積變化的承受能力，從而指導(dǎo)冷凍方案的設(shè)計(jì)。 實(shí)驗(yàn)方法：從實(shí)驗(yàn)室附近屠宰中心獲得豬卵巢，穿刺卵泡獲得未成熟卵，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，選取排出第一極體的MⅡ期豬卵母細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)早期研究獲得的豬卵母細(xì)胞體積與

2、細(xì)胞外滲透壓的函數(shù)關(guān)系，推算一系列豬卵母細(xì)胞體積所對(duì)應(yīng)的滲透壓，配置相應(yīng)滲透壓濃度的蔗糖溶液。1、觀察不同體積變化導(dǎo)致的豬卵母細(xì)胞孤雌激活的現(xiàn)象。體外成熟的豬卵母細(xì)胞隨機(jī)分為13組，經(jīng)不同滲透壓濃度蔗糖溶液處理10分鐘后，再移入等滲液平衡10分鐘。然后用受精液與胚胎培養(yǎng)液依次培養(yǎng)，觀察自發(fā)的孤雌激活現(xiàn)象，并記錄囊胚形成率。2、觀察不同體積變化對(duì)豬卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響。將體外成熟的豬卵母細(xì)胞隨機(jī)分為9組，經(jīng)不同濃度蔗糖溶液處理后，與凍融

3、豬精子共培養(yǎng)4-6小時(shí)受精，轉(zhuǎn)至胚胎培養(yǎng)液，記錄各組囊胚形成率。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、觀察不同體積變化導(dǎo)致的豬卵母細(xì)胞孤雌激活的現(xiàn)象。0.3V-0.6V和1.4V-2.0V對(duì)應(yīng)的滲透壓濃度下觀察到一定的孤雌激活率，提示豬體外成熟卵母細(xì)胞體積的過(guò)度膨脹或收縮均能導(dǎo)致孤雌激活的發(fā)生。2、觀察不同體積變化對(duì)豬卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響。不同體積變化對(duì)豬卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響。隨著細(xì)胞體積的逐漸增大或縮小，其囊胚率逐漸下降。經(jīng)曲線(xiàn)估計(jì)，發(fā)現(xiàn)囊胚形

4、成率與體積變化兩者間符合二元二次方程：Y=-1.104+3.945X-1.946X2；R2=0.641，模型擬合效果較好。 結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞的過(guò)度擴(kuò)張和收縮將導(dǎo)致較高的孤雌激活的發(fā)生，而在一定范圍內(nèi)，卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能隨體積的擴(kuò)張和縮小而降低。以往文獻(xiàn)多報(bào)道滲透壓變化對(duì)發(fā)育潛能的影響，而滲透壓變化與細(xì)胞體積變化密切相關(guān)。本研究從體積變化的角度觀察了其對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在密切的函數(shù)關(guān)系。這更好的闡

5、述了滲透壓/體積對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能影響的規(guī)律，為卵母細(xì)胞冷凍方案的設(shè)計(jì)提供了有利的基礎(chǔ) 第二部分幾種改良人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍方案的比較 研究背景：人卵母細(xì)胞冷凍方案不斷得到改良。本研究針對(duì)非滲透性冷凍保護(hù)劑（蔗糖）的濃度，冷凍步驟，及融解條件分別進(jìn)行改良，以期提高人卵母細(xì)胞冷凍后的發(fā)育潛能。 實(shí)驗(yàn)方法：收集ⅣF周期短時(shí)受精中獲取的MⅠ期卵母細(xì)胞和ICSI周期中消化顆粒細(xì)胞后獲取的MⅠ期卵母細(xì)胞。選擇經(jīng)16-24小

6、時(shí)的體外培養(yǎng)后成熟的卵母細(xì)胞（MⅡ期卵母細(xì)胞）隨機(jī)分組：對(duì)照組（常規(guī)冷凍法），0.35M蔗糖組，四步法組和37℃融解組。對(duì)照組采用常規(guī)方法冷凍融解體外成熟的卵母細(xì)胞。其余各組方法如下： 實(shí)驗(yàn)1、不同蔗糖濃度的應(yīng)用：本研究使用0.35M濃度的蔗糖進(jìn)行玻璃化冷凍，并相應(yīng)降低融解過(guò)程中的蔗糖濃度至0.8M、0.4M、0.2M。比較對(duì)照組（0.5M蔗糖濃度）和0.35M蔗糖組對(duì)冷凍融解后卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能的影響。 實(shí)驗(yàn)2、不同冷

7、凍步驟的應(yīng)用：本試驗(yàn)在0.35M蔗糖濃度基礎(chǔ)上使用四步法冷凍卵母細(xì)胞，與0.35M蔗糖組（二步法）進(jìn)行比較，融解后觀察兩種冷凍方案對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響。 實(shí)驗(yàn)3：融解過(guò)程中不同溫度的應(yīng)用：本實(shí)驗(yàn)分別在37℃和室溫20～22℃條件下進(jìn)行融解過(guò)程（第一步均在37℃條件下），比較37℃融解組和四步法組（室溫融解）融解后卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、兩種蔗糖濃度的玻璃化冷凍方案之間成活率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率沒(méi)有顯著

8、性差異。2、四步法冷凍獲得了較高的成活率和受精率，但優(yōu)質(zhì)胚胎率較低。兩組比較各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著性差異。3、37℃融解組與室溫組比較，成活率、受精率及囊胚形成率均無(wú)顯著性差異。4、對(duì)四種凍融方案進(jìn)行進(jìn)一步綜合分析，發(fā)現(xiàn)37℃組與對(duì)照組比較其優(yōu)質(zhì)胚胎率有顯著性差異（P<0.05，F(xiàn)isher精確概率法）。 結(jié)論：1、使用0.35M蔗糖濃度在冷凍融解后獲得的成活率、受精率和優(yōu)胚率與0.5M蔗糖濃度比較均無(wú)顯著性差異。證明較低濃度的蔗糖（

9、0.35M）可以應(yīng)用于玻璃化冷凍方案，而且較低的蔗糖濃度可以一定程度上降低滲透壓變化的幅度，更好的保護(hù)卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。2、使用四步法冷凍與二步法比較，沒(méi)有提高卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，反而其優(yōu)質(zhì)胚胎率較低。盡管兩種方案在各項(xiàng)指標(biāo)比較中無(wú)顯著性差異，但本研究提示延長(zhǎng)細(xì)胞與冷凍保護(hù)劑接觸的時(shí)間會(huì)對(duì)細(xì)胞發(fā)育造成相當(dāng)程度的損傷，因此四步法并沒(méi)有體現(xiàn)其減小細(xì)胞體積變化帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)。3、37℃融解組與室溫組相比，沒(méi)有降低卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，而且獲得了較

10、好的優(yōu)質(zhì)胚胎率和囊胚形成率，分析認(rèn)為由于融解液中沒(méi)有滲透性冷凍保護(hù)劑的參與，較高的溫度不會(huì)增加冷凍保護(hù)劑毒性損傷。4、對(duì)四種凍融方案進(jìn)行進(jìn)一步綜合分析，發(fā)現(xiàn)37℃組與對(duì)照組比較其優(yōu)質(zhì)胚胎率有顯著性差異，進(jìn)一步證明0.35M蔗糖和37℃條件融解的改良方案的確對(duì)卵母細(xì)胞玻璃化冷凍具有積極意義，可以進(jìn)一步推廣應(yīng)用。 第三部分人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)的初步臨床應(yīng)用 研究背景：人卵母細(xì)胞冷凍可以避免大量胚胎冷凍保存和剩余胚胎去向引

11、起的一些倫理和法律的問(wèn)題，能為各種原因造成的卵巢功能衰竭的婦女提供一條儲(chǔ)備生育能力的途徑，進(jìn)一步優(yōu)化及合理化輔助生育技術(shù)，在臨床應(yīng)用上有非常重要的意義。本研究目的在于探討人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)在臨床應(yīng)用的效果。 研究方法：病人知情同意后獲取的卵母細(xì)胞。消化去除顆粒細(xì)胞，選擇MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍。卵母細(xì)胞全部采用Medicult商品化玻璃化冷凍融解液，對(duì)成熟卵母細(xì)胞（MⅡ）進(jìn)行冷凍融解。以Cryoloop為細(xì)胞承載器，每個(gè)尼龍

12、環(huán)裝載2-3個(gè)卵母細(xì)胞。融解過(guò)程第一步在在37℃條件下進(jìn)行，然后采用兩種環(huán)境溫度進(jìn)行剩余步驟：在37℃和室溫20℃。所有成活卵母細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3小時(shí)后進(jìn)行ICSI，記錄受精、胚胎發(fā)育情況和妊娠結(jié)局。 結(jié)果：1、11例病人移植新鮮胚胎和冷凍胚胎后未獲妊娠。比較同一病人融卵周期ICSI受精率高于取卵周期，差異有顯著性（卡方檢驗(yàn)，P<0.05），取卵周期優(yōu)質(zhì)胚胎率高于融卵周期，并有顯著性差異（卡方檢驗(yàn)，P

13、5）。2、11例病人接受冷凍供卵，卡方檢驗(yàn)比較接受供卵-融凍卵周期與供卵者新鮮周期的受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率均存在顯著性差異（P<0.05）。3、37℃融解13個(gè)周期，室溫組融解12個(gè)周期。統(tǒng)計(jì)分析37℃組受精率高于室溫組，兩者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（卡方檢驗(yàn)，P<0.05），余各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著性差異。 結(jié)論：對(duì)于取卵數(shù)較多的病人進(jìn)行部分卵母細(xì)胞冷凍保存，有利于避免在新鮮周期（尤其是ⅣF周期）由于受精障礙等不可預(yù)知原因損失全部卵母細(xì)胞。而且綜合

14、考慮，將病人部分卵母細(xì)胞行玻璃化冷凍，有利于病人自身生育能力的儲(chǔ)備，同時(shí)也給卵巢功能衰竭婦女或有遺傳性疾病婦女帶來(lái)生育的機(jī)會(huì)，具有重要的臨床意義。37℃融解方案和20℃融解方案相比，其成活率、受精率、優(yōu)胚率和著床率均有不同程度的提高，其中正常受精率有顯著性差異。目前病例數(shù)量仍然較少，因此需要進(jìn)一步積累臨床數(shù)據(jù)以說(shuō)明問(wèn)題。但本實(shí)驗(yàn)證實(shí)RT冷凍/37℃融解方案并未增加高溫下冷凍保護(hù)劑的毒性作用，是一項(xiàng)較安全的改良措施。綜上所述，冷凍人卵母細(xì)