卵母細(xì)胞玻璃化冷凍液配方的改良研究及臨床應(yīng)用.pdf

1、第一部分：改良玻璃化冷凍液對體外成熟卵母細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后發(fā)育潛能的影響
　　目的：針對目前卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果不穩(wěn)定的問題，參考常用的兩種卵母細(xì)胞玻璃化冷凍液配方，設(shè)計(jì)一種保持滲透性不變而降低各種滲透性冷凍保護(hù)劑濃度的玻璃化冷凍液配方，利用ICSI患者捐贈(zèng)的未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍方法的研究，驗(yàn)證新型改良卵母細(xì)胞玻璃化冷凍液對體外成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果的影響。
　　方法：收集常規(guī)ICSI患者捐贈(zèng)的未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體

2、外成熟培養(yǎng)，將18～24小時(shí)體外成熟的卵母細(xì)胞作為研究對象。隨機(jī)分為4組，其中三組采用不同的方法進(jìn)行冷凍保存，分別為B組（EG/DMSO法）、C組（EG/PROH法）和D組（EG/DMSO/PROH法），解凍后進(jìn)行授精和胚胎培養(yǎng)，A組為對照組，培養(yǎng)成熟后直接進(jìn)行授精和胚胎培養(yǎng)。以每解凍卵母細(xì)胞為分母，觀察計(jì)算存活率、受精率、優(yōu)胚率、囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率。
　　結(jié)果：不同玻璃化冷凍配方對體外成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能均有較大的影響，其

3、受精率、優(yōu)胚率和囊胚形成率均顯著低于新鮮組(P＜0.01)，盡管D組的存活率、2PN率、優(yōu)胚率、囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚率高于B組和C組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并無顯著性差異(P＞0.05)。D組的存活率最高(84.8％)，與B(77.2％)、C組(80.0％)比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。D、B、C各組的2PN率分別為46.7％、42.4％和40.0％，優(yōu)胚率分別為5.7％，2.2％和2.2％，囊胚形成率為7.6％，2.2％和3.3％(P＞0

4、.05)，僅D組形成了優(yōu)質(zhì)囊胚，與A組比較沒有顯著性差異(1.9％和6.7％，P＞0.05)。
　　結(jié)論：改良卵母細(xì)胞玻璃化冷凍液可以改善體外成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，有助于獲得更多的優(yōu)質(zhì)囊胚。
　　第二部分：改良玻璃化冷凍對體外成熟卵母細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響
　　目的：卵母細(xì)胞作為人體最大的細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其對低溫和高滲環(huán)境更加敏感，同慢速冷凍一樣，玻璃化冷凍也可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。針對卵母細(xì)胞骨架

5、系統(tǒng)中的微絲分布和電鏡下超微結(jié)構(gòu)形態(tài)，進(jìn)一步驗(yàn)證改良卵母細(xì)胞玻璃化冷凍液對體外成熟卵母細(xì)胞解凍后形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　方法：收集常規(guī)ICSI患者捐贈(zèng)的未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，將體外成熟的卵母細(xì)胞用兩種冷凍方案冷凍解凍后進(jìn)行形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)評價(jià)。實(shí)驗(yàn)組分為傳統(tǒng)組（EG/DMSO冷凍法）和改良組（EG/DMSO/PROH冷凍法），對照組為新鮮體外成熟卵母細(xì)胞，直接固定后行超微結(jié)構(gòu)觀察。每組卵母細(xì)胞均進(jìn)行共聚焦顯微鏡下微絲

6、分布觀察和透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察。
　　結(jié)果：倒置鏡下，冷凍兩組均有部分卵母細(xì)胞存在周邊空泡狀結(jié)構(gòu)。改良組的空泡發(fā)生率為18.7％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)組(66.7％)(P=0.000)。改良組的微絲分布正常率(43.8％)略高于傳統(tǒng)組(33.3％)，兩者比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。改良組和傳統(tǒng)組的微絲分布正常率均低于對照組(71.1％)(分別是P＜0.05和P＜0.01)，透射電鏡結(jié)果顯示，無論是傳統(tǒng)組還是改良組，冷凍復(fù)蘇后卵母

7、細(xì)胞中的空泡狀結(jié)構(gòu)略多于新鮮卵母細(xì)胞。而線粒體和空泡的形態(tài)結(jié)構(gòu)與對照組比較沒有明顯差異，冷凍兩組中卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒的數(shù)量略有減少，且更加繞周邊分布，未觀察到明顯的皮質(zhì)顆粒外排現(xiàn)象。
　　結(jié)論：改良玻璃化冷凍方案較傳統(tǒng)玻璃化冷凍方案可以更加有效的改善卵母細(xì)胞解凍后的光鏡下形態(tài)，兩種玻璃化冷凍方案都會(huì)影響體外成熟卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　第三部分：不同玻璃化冷凍液對卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響及其臨床結(jié)局評價(jià)
　　目的：評價(jià)一種

8、卵母細(xì)胞玻璃化冷凍液配方的優(yōu)劣，最直接的證據(jù)是臨床妊娠結(jié)果，本研究回顧性分析了使用不同玻璃化冷凍液玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)數(shù)據(jù)及臨床結(jié)局，為改良冷凍液的推廣應(yīng)用找到臨床證據(jù)。
　　方法：收集2012年～2013年的卵母細(xì)胞解凍的所有患者的數(shù)據(jù)，包括自卵使用患者和接受供卵的患者。卵母細(xì)胞來源于2008年～2013年不同時(shí)間冷凍的卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞冷凍動(dòng)機(jī)以獲卵數(shù)超過22枚者為多，部分因?yàn)槿÷讶杖【　＝鈨鲋芷诨颊呔捎锰娲?/p>

9、期方案，卵母細(xì)胞胞解凍后行黃體支持。記錄冷凍卵母細(xì)胞所用的試劑類型（MC組、KT組和改良組）、解凍卵母細(xì)胞使用者的年齡、冷凍存活率、受精率、優(yōu)胚率、囊胚形成率、冷凍和移植胚胎數(shù)、臨床妊娠率及著床率。同時(shí)計(jì)算每解凍卵母細(xì)胞獲得的胚胎利用率。
　　結(jié)果：自卵使用數(shù)據(jù)中，卵母細(xì)胞的冷凍復(fù)蘇率以改良組最高(92.0％)，顯著高于其他兩組（MC和KT組分別是88.2％和77.3％）(P＜0.05)。改良組受精卵分裂后獲得的優(yōu)胚率最高(35.

10、8％)，與MC和KT組（29.0％和28.3％）相比有顯著性差異(P＜0.05)。胚胎移植后的臨床妊娠率與著床率各組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)，MC、KT和改良配方組臨床妊娠率分別是37.2％，30.2％和39.6％，著床率分別是21.9％、18.8％和27.4％。但改良組每周期胚胎移植個(gè)數(shù)是1.89±0.59，顯著低于MC組(2.28±0.83)(P=0.000)，也少于KT組(2.02±0.93)(P＞0.05)。按照每解凍

11、卵母細(xì)胞的效率看，改良配方組的卵母細(xì)胞授精后獲得的優(yōu)胚率顯著高于MC組和KT組(P＜0.01)。每解凍卵母細(xì)胞獲得的胚胎利用率高于另外兩組，但沒有顯著性差異(P＞0.05)。在供卵使用數(shù)據(jù)中僅用到了MC試劑和KT試劑，兩組比較，存活率、受精率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率及各項(xiàng)卵母細(xì)胞利用率，均沒有顯著性差異(P＞0.05)，供卵組的各項(xiàng)數(shù)據(jù)均比自卵組好，臨床妊娠率可以分別達(dá)到50％和43.5％。
　　結(jié)論：改良冷凍液配方獲得了較商品化試劑